Biz döllenmemiş toplanması tarif<em> Xenopus tropicalis</em> Yumurta ve bir mayoz II-tutuklandı yumurta özü üretim. Bu yumurta özü mikrotübüller ve mikrotübül-ilişkili RNA'lar saflaştırmak için kullanılabilir.
Birçok organizma mekansal ve zamansal kontrolü gen özgü hücre içi hedeflere mRNA lokalize. Son çalışmalar transcriptome çoğunluğu hücreleri ve embriyolarda bir tesadüfi olmayan konuma lokalize olduğunu göstermiştir. Lokalize mRNA belirlemek için bir yaklaşım biyokimyasal ilgi bir hücresel yapı arındırmak için ve tüm ilişkili transkript belirlemektir. Yakın zamanda geliştirilen yüksek verimli sıralama teknolojilerini kullanarak artık bir hücre içi yapı ile ilgili tüm RNA'lar tanımlamak için basittir. Transkriptlerini tanımlamayı kolaylaştırmak için, bir tam sıralı bir organizma genomu ile birlikte çalışmak için gereklidir. Hücre içi yapıların biyokimyasal arıtma için bir çekici sistemi kurbağa Xenopus laevis üretilen yumurta alıntılar vardır. Ancak, X laevis şu anda transkript kimlik engellemektedir tam sıralı genom, yoktur. Bu yazıda bir yöntem tarifilgili kurbağa, X gelen yumurta özler üretmek için Bir tam sıralı bir genomu olan tropicalis. Biz mikrotübül polimerizasyon, arıtma ve transkript izolasyonu için ayrıntıları. Bu makalede mikrotübüle bağlı transkript tanımlanması için özel bir yöntem tarif ederken, bunun kolayca diğer hücre içi yapılarına uygulanabilir ve lokalize RNA'lar belirlenmesi için güçlü bir yöntem sağlar inanıyoruz.
Gen ifadesinin mekansal ve zamansal kontrolünün tüm hücreler için önemlidir ve 1 dizilmesine erken evredeki embriyonik bölgesinin kontrolü için özellikle önemlidir. Gen ifadesinin mekansal kontrol hücreleri ya da embriyolar içinde belirli bir noktaya mRNA'ların aktif lokalizasyonu ile elde edilir. Çok sayıda çok büyük hücre tipleri (örneğin, oositler, embriyolar ve nöronlar) mRNA lokalizasyonu kodlanmış protein eylem sözlük protein ekspresyonu sınırlamak için kullanılır. Yerelleştirilmiş bir mRNA protein üretimi birçok tur katalize çünkü bireysel protein molekülleri tespit etmek için daha bir mRNA tespit etmek için daha etkilidir. Onlar daha kodlu protein 2 lokalizasyonu neden olmaktadır hedeflerine, ulaşana kadar lokalize mRNA genellikle translationally baskı vardır. Embriyonik desenlendirme kontrol etmek için RNA lokalizasyonu çok iyi belgelenmiş durumda ek olarak, çeşitli çalışmalar lokalize mRNA belgeledikodlanmış protein eylem sitesine. Tanınmış örnekler hareketli fibroblast öncü için β-aktin 3 ve Arp2 / 3 4 mRNA lokalizasyonu ve mayoz ve mitoz iğ 5-7 birçok mitoz düzenleyiciler için mRNA lokalizasyonu içerir.
Lokalize mRNA'ların klasik örneklerin çoğu anne etkisi mutasyonlar için genetik ekranlarında belirlendi ve daha sonra lokalize RNA'lar kodlamak için belirlenmiştir. Ancak, son genom çalışmaları lokalize RNA'lar kapsamına geniş bilgi sağlar başladı. Drosophila embriyolar in situ hibridizasyon ekranında yeni bir tüm mRNA'ların ~ 70% birçok yeni destinasyonlarda 8 dahil olmak üzere belirli bir yeri, sahip olduğunu göstermiştir. Fare fibroblastlardan pseudopodia saflaştırılması lokalize mRNA 9 çeşitli bir grup belirledi. Mayoz Xeno gelen mikrotübül biyokimyasal arıtma kullanarak gruptan çalışmairin yumurta mil 5,7 ile copurify mRNA'ların tespit yüzlerce ayıklar. Çalışmalarımız mRNA'lar, kodlanmış protein eylem sitesine lokalize olduğu fikrini desteklemektedir, mikrotübül-lokalize mRNA'ların çoğunluğu mitoz kontrol işlevi proteinleri kodlayan gösterdi. Ayrıca, biyokimyasal arıtma tarafından bir hücre içi kısmını mRNA zenginleştirme tespit yeteneği lokalize mRNA belirlenmesi için bu yaklaşımın gücünü vurgulamaktadır.
En lokalize RNA'lar nihai hedef 10 ulaşım ulaşmak için, aktin veya mikrotübül ya, hücre iskeleti aktif taşıma kullanın. Bu iskelet işlemleri özetlemek olduğunu in vitro sistemde bir olması için gerekli olan biyokimyasal bir yaklaşım kullanarak belirli hedeflere lokalize RNA'lar ölçüde ve türleri daha iyi anlamak için. Sitoskeletal biyoloji eğitimi için önde gelen sistemlerinden biri üretilen yumurta özleri olankurbağa Xenopus laevis. X den döllenmemiş yumurta laevis yumurta özleri iskelet süreçleri geniş bir dizi çalışma için yıllardır kullanılmaktadır ve iskelet montaj ve dinamikleri 11 kontrol mekanizmaları ve moleküllerin anlayışımızı çok katkıda bulunmuştur. Ayrıca, X. laevis yumurta özü ve mikrotübüllerin 12,13 ilişkili proteinlerin büyük ölçekli saflaştırılması için uygun olan ve yumurta özü 14-16 çeşitli üretimi için iyi tasarlanmış bir yöntem vardır. Bununla birlikte, genomik çalışmaları için X'in kullanımı için çeşitli dezavantajları vardır bir model sistem olarak laevis.
On yıllardır Xenopus laevis kurbağa büyük oosit büyüklüğü ve sağlam dış gelişme 17 nedeniyle gelişim ve hücre biyolojisi, çalışma için güçlü bir sistem olmuştur. Ayrıca, birçok hücresel processe özetlemek olabilir yumurta özü sistemlerinin geliştirilmesibir test tüpünde s bu kurbağa güçlü bir deneysel model yaptı. Ancak, Xenopus laevis genome.In kontrast allotetraploid doğanın yavaşladı olan bir tam genom dizisi, eksikliği engel olmuştur, bir yakından ilişkili türler, Xenopus tropicalis 2010 18 sıralı bir diploid genom vardır. Iken X tropicalis X gibi deneysel olarak izlenebilir değildir laevis 17 bir sıralı genomunun kullanılabilirliği genom geniş analizleri yapmak için çekici bir model sistem yapar.
Bu yazıda X den mayoz II-, sitostatik faktör-tutuklandı özler (BOS) yapmak için bir yöntem tarif tropicalis 19. Biz o zaman bu özü mikrotübüllerin ve ilgili RNA'lar arındırmak için basit bir yöntem tarif. RNA'lar sonra yeni geliştirilmiş yüksek verimlilik sıralaması teknolojileri kullanarak sıralama için uygun kütüphaneler dönüştürülebilir. Kütüphaneler kezbunlar toplam özü göre mikrotübül örnek zenginleşmiş spesifik mRNA tespit etmek kurbağa genomuna hizalanabilir sıralanır. Bu bir genom ölçekte mikrotübül hedefli mRNA lokalizasyon tespit etmek için güçlü bir yöntem sağlar. Lokalize mRNA tespit edebilmek olmasının yanı sıra, yüksek verimli sıralama ve sıralı genomunun kullanımı kamu veritabanı açıklamalar şu anda mevcut olmayan yeni transkript keşfetme imkanı sunuyoruz.
Bu yazıda X BOS-tutuklandı yumurta özleri üretmek için basit bir yöntem tarif var tropicalis 19 ve mikrotübül ilişkili RNA'lar 7 incelemek için bu özü kullanın. X den BOS-tutuklandı yumurta özler üretmek için temel prosedür X için kullanılan tropicalis aynıdır birkaç önemli farklılıklar ile laevis. X ile çalışan en zor yönlerinden biri tropicalis kurbağa X karşılaştırılabilir mikrotübül çekirdeklenme veya milli montaj aktivite ile bir özü için yeterli kaliteli yumurta elde edilir laevis yumurta ayıklar. Mayoz II hücre döngüsü tutuklama, X için hormon enjeksiyonları arasındaki aralıktan kayma önlerken en uygun yumurtlama koşulları elde etmek için tropicalis X için kullanılan daha kısadır laevis ve yumurtlama başına üçüncü hCG enjeksiyonundan zamanlama da çok kısadır. X ile hCG enjeksiyonundan t zamanlama laeviso yumurtlama başında bu tampon içine bir gecede döşenecek yumurta için uygun ve etkili olduğu gibi. Ancak, hCG enjeksiyonu ve yumurta arasındaki kısa zaman X ile döşeme sık sık el kurbağalar yumurta ifade için gerekli olan tropicalis. Iki farklı kurbağalar yumurta özü yapma arasındaki bir diğer önemli fark dejellying adımdır. X ile yumurta laevis bu jöle kat yumurta beher ne kadar yakın yerleştirileceğini gözlemleyerek çözünmüş ne zaman belirlemek kolaydır o kadar büyüktür. Dejellying reaksiyon başlangıcında, yumurta daha yoğun paketi başlar. Ancak, X. tropicalis yumurta çok daha küçük ve jöle kat tek başına yoğunluğu ambalaj yumurta tarafından çözülür ne zaman belirlemek için oldukça zor olabilir. Biz, jöle kat çözündürüldü ne zaman tamamlandığını belirlemek için en güvenilir yöntem hayvan (siyah) ve bitkisel (beyaz) kutup yönü izleme olduğunu bulduk. Ne zaman tüm bitkisel kutup oribeher altına doğru ent jöle kat ekstresi ile devam etmek için yeterli kaldırıldı. Son olarak, oysa X laevis yumurta özü serin sıcaklıklarda saklanabilir (4-12 ° C) bunu X korumak için kritik olduğunu gözlemledik hazırlanması ve deneysel manipülasyonlar sırasında oda sıcaklığında tropicalis yumurta özü (20-25 ° C) biyokimyasal faaliyet korumak için. Çünkü kullanım kolaylığı farklılıklar biz X kullanmayı tercih Yumurta özü üretimi için laevis kurbağa. Ancak, ihtiyaç ya da sıralı genom, X ile bir organizma tarafından kolaylaştırdı deneyler için tropicalis mükemmel bir alternatif sistemidir.
Bu raporda açıklanan olduğunu yöntemi mikrotübül polimerizasyon ikna etmek için bir mikrotübül-dengeleyici ajan olarak taksol kullanır. Taksol mikrotübül saflaştırılmış büyük ölçekli izolasyon kolaylaştıran sağlam bir mikrotübül stabilize edici, çünkü bu yöntem seçtik. Gibi bir yöntem incibiz tarif de olası alternatif mikrotübül polimerizasyon yöntemleri kullanılarak mikrotübül ilişkili protein ve RNA karşılaştırarak geliştirilebilir. Alternatifler GTP bağlı polimerizasyon (klasik bir teknik), 22 veya kromatin odaklı mili montaj 23 neden olduğu mikrotübül taklit etmek için bir mikrotübül polimerizer olarak Ran-GTP kullanarak kullanarak polimerizasyon içerebilir. Son olarak, mikrotübül polimerizasyon en yakın mitoz (centrosome, kromatin ve kinetochore aracılı) sırasında çekirdeğini olan mikrotübül türlerine taklit olacağını ikna etmek için sperm çekirdekleri saflaştırılmış kullanın. Mikrotübül çekirdeklenme bu alternatif kaynaklara dezavantajları çekirdekleştirici ajanlar taksol kadar hazır değildir ve onlar çekirdekli yok ya da verimli Taksol olarak mikrotübül stabilize. Bu nedenle, bu yöntemlerin her büyük ölçekli saflaştırılması için kullanmak daha zor olacaktır. Mikrotübül Nükleatörler birden fazla farklı türde karşılaştırma avantajıbu protein ve / veya mikrotübül çekirdeklenme her yolu özgü RNA'lar belirlemek mümkün olabilir olmasıdır.
Burada anlattığımız yöntem, amfibi sitoplazmik özleri yararlanır. Ancak, bu yaklaşım diğer organizmalardan özü sisteminin kullanımı için uzun olabilir. Mitotik özleri sadakatle mikrotübül montaj birçok açıdan özetlemek bu senkronize insan doku kültürü hücreleri 24 tanımlanmıştır. Başarıyla HeLa hücreleri 5'ten mikrotübüle bağlı RNA'lar tanımlamak için bu ekstreler kullandık. Mikrotübül ilişkili RNA'lar incelenmiş değil de benzer mikrotübül arıtma planları, birçok farklı organizmalar 25,26 için tanımlanmıştır. Burada açıklanan yaklaşım, mikrotübül çekirdekleştirici yeteneğine sahip bir konsantre sitoplazmik özü üretebilen herhangi bir organizma ile kullanılabilir.
Son olarak, her ne kadar bu biz de yaklaşımBurada yazıcı mikrotübül ve ilişkili protein ve RNA'lar arıtma tartışır, bu yaklaşım diğer hücre içi yapılara genel olabilir. En lokalize mRNA biyokimyasal yöntemlerle tespit edilmemiş olsa da DNA ve RNA dizi teknolojilerindeki son gelişmeler bu yaklaşımın yerel RNA'lar tanımlamak için cazip bir yöntem yapmak. Bu yaklaşımda ilgi herhangi bir hücre içi veya alt embriyo yapısı izole veya saf olabilir. Daha sonra ilgili protein ve RNA bir genom geniş ölçekte tespit edilebilir. RNA'lar sonra, toplam hücre ya da zenginleştirilmiş lokalize RNA'lar tespit etmek embriyo RNA içeriği ile karşılaştırılabilir. Bu yaklaşım, bütün olarak (27, Xenopus birinci lokalize RNA'lar tespit yaklaşım benzer hayvansal ve bitkisel ayırma), yumurta, aktin ilişkili RNA'lar ER-ilişkili RNA'lar mitokondri ilişkili RNA'lar ile ya da herhangi bir olabilir hücre içi yapısı için kullanılabilir bozulmamış ilişkili RNA'lar ile daha da saflaştırılabilir. Göremikrotübül ilişkili RNA üzerinde çalışmalarımızı bu belirli bir yerde yeni bir protein bu işlevi keşfetmek için mükemmel bir yöntem olacağını tahmin. Ayrıca, tüm yerelleştirilmiş RNA'lar yerini ve kapsamı belirlenmesi hücreleri ve embriyoların gen ekspresyon kontrol etmek için mRNA lokalizasyon kullanarak nasıl içine fikir verecektir.
The authors have nothing to disclose.
REAGENTS | |||
Xenopus tropicalis | NASCO | LM00823MX | |
human Chorionic Gonadotropin | Sigma-Aldrich | CG10 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C8106 | |
sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Leupeptin | Sigma-Aldrich | L9783 | |
Pepstatin | Sigma-Aldrich | P5318 | |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 | |
Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
Gelatin, porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
Taxol | Sigma-Aldrich | T7191 | |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
L-Cysteine, free base | USB Corporation | 14030 | |
Cichlid Lake Salt | Seachem | 47894 | |
Marine salt | Seachem | SC7111 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
EQUIPMENT | |||
1 ml syringes | BD Biosciences | 309659 | |
18 gauge needles | BD Biosciences | 305195 | |
30 gauge needles | BD Biosciences | 305106 | |
Rubbermaid Plastic bucket | Amazon | 6306 | |
Beckman Polyallomer 2 x ½ inch Ultracentrifuge tubes | Beckman | 326819 | |
15 ml round-bottomed glass centrifuge tubes | Fisher Scientific | 45500-15 | |
Rubber adapter sleeves for 15 ml tubes | Kimble-Chase | 45550-15 | |
5 ¾ inch glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
14 ml polypropylene round-bottom tube | BD Biosciences | 352059 | |
Sorvall HB-6 rotor | Thermo Scientific | 11860 | |
Sorvall RC-6 centrifuge | Thermo Scientific | 46910 |