Miglioramento della preparazione e la conservazione di fette mouse ippocampo per una registrazione molto stabile e riproducibile di potenziamento a lungo termine
Summary
Questo articolo presenta una metodologia completa per preparare e conservare<em> In vitro</em> Acuta fettine di ippocampo di topi adulti. Questo protocollo permette la registrazione di potenziamento a lungo termine di lunga durata molto stabile (LTP) per più di 8 ore con un tasso di successo del 95%.
Abstract
Potenziamento a lungo termine (LTP) è un tipo di plasticità sinaptica caratterizzata da un aumento della forza sinaptica e crede di essere coinvolti nella codifica della memoria. LTP suscitato nella regione CA1 di fettine di ippocampo acute è stata ampiamente studiata. Tuttavia i meccanismi molecolari alla base della fase di questo fenomeno manutenzione sono ancora poco conosciuti. Questo potrebbe essere dovuto in parte alle diverse condizioni sperimentali utilizzate da diversi laboratori. Infatti, la fase di mantenimento LTP è fortemente dipendente da parametri esterni come ossigenazione, temperatura e umidità. Esso dipende inoltre parametri interni come orientamento del piano di tranciatura e vitalità fetta dopo dissezione.
L'ottimizzazione di tutti questi parametri permette l'induzione di un potenziamento molto riproducibile e molto stabile a lungo termine. Questa metodologia offre la possibilità di esplorare ulteriormente i meccanismi molecolari coinvolti nella crescita stabilein forza sinaptica in fettine di ippocampo. Si evidenzia anche l'importanza delle condizioni sperimentali in vitro in indagini di fenomeni neurofisiologici.
Introduction
Al giorno d'oggi, non vi è limitata comprensione di come le memorie complesse vengono memorizzate e richiamate a livello di circuito neuronale. Tuttavia, un'ipotesi unificante di memoria è disponibile e ampiamente riconosciuti: memorie sono memorizzati come cambiamenti nella forza delle connessioni sinaptiche tra i neuroni nel sistema nervoso centrale. Di per sé, la ricerca sulla plasticità sinaptica ha largamente beneficiato di due scoperte svolta. (1) In un esperimento seminale, Bliss e Lomo 1, utilizzando il coniglio anestetizzato intatta, trovato che la consegna di una breve alta frequenza (1 sec, 100 Hz) impulso alla via perforante dell'ippocampo causato una lunga durata (vari ore) aumento delle relative connessioni sinaptiche. Questo fenomeno affascinante è stato chiamato "potenziamento a lungo termine" o LTP da Douglas e Goddard nel 1975 2. (2) Successivamente, è stato trovato che un fenomeno simile potrebbe essere innescato in fettine cerebrali (0,4 mm) mantenuta artificialmente di vita in vitro </em>. La LTP più studiato è stato osservato in vitro, fornendo uno o più tetani ad un fascio di assoni (cosiddetti collaterali Schaffer) durante la registrazione del campo risultante sinaptica eccitatoria potenziale evocato nei neuroni piramidali della cosiddetta regione CA1. I meccanismi di induzione di LTP sono stati ampiamente rivelato. Fondamentalmente, un afflusso di Ca 2 + attraverso i recettori NMDA attiva enzimi con due conseguenze: una fosforilazione di recettori AMPA (che aumenta la loro efficienza) e una incorporazione di recettori AMPA extra nella membrana postsinaptica 3. Per contro, i meccanismi della fase di mantenimento LTP sono largamente sconosciuti, soprattutto perché é sperimentalmente molto più difficile mantenere una fetta sano per molte ore che per 30 a 60 min.
Molti studi sono stati dedicati alla comprensione dei meccanismi di LTP e teorie interessanti sono state elaborate nel corso degli anni, 4-11. Ma ONUfino ad ora, i meccanismi molecolari precisi alla base della crescita stabile in forza sinaptica non sono stati chiariti. Questo potrebbe essere dovuto alla difficoltà di riprodurre i risultati precedenti in laboratori diversi utilizzando tecniche diverse per la preparazione e la manutenzione di fettine ippocampali. Nel loro documento metodologia, Sajikumar et al. 12 ha sottolineato l'importanza delle condizioni sperimentali per la preparazione di fettine di ippocampo di ratto e la registrazione delle LTP stabile. In questo video vi presentiamo tutte le fasi di ottimizzazione sviluppati nel nostro laboratorio nel corso degli anni di essere in grado di registrare un LTP molto stabile nel topo fettine di ippocampo.
Questa ottimizzazione è stata fatta dai protocolli sviluppati e utilizzati con successo da altri laboratori che studiano i meccanismi di LTP in topi e ratti 13 11. Esso consente a ricercatori esperti di indurre e registrare un tempo molto lungo LTP duratura in topi adulti con un alto tasso di successo. Il pbase hysiological della indotto LTP è stato attentamente verificato e dimostrato 14. In questo lavoro la metodologia, si dimostra che le modifiche delle condizioni sperimentali, come la temperatura o l'ossigenazione possono avere un profondo impatto sulla manutenzione LTP, mentre la procedura di dissezione può modificare profondamente le fette eccitabilità. Si deve inoltre sottolineare che il controllo preciso di tutti questi parametri richiede una formazione di diversi mesi per gli studenti alle prime armi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo sviluppato nel nostro laboratorio un protocollo risultante dalla combinazione dei metodi sviluppati e utilizzati da altri laboratori aventi un grande esperienza in registrazioni LTP 11,17. Questo protocollo è atto ad adulto ippocampo mouse e può essere utilizzato in animali di qualsiasi età e qualsiasi sfondo genotipo. Esso permette anche l'analisi LTP in topi transgenici sviluppare malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer 18,19.
L'utiliz…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Bernard Foucart per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo belga per la Ricerca Scientifica (FRS-FNRS) e dal Fondo regina Elisabetta per la ricerca medica. Agnès Villers è assegnista di ricerca presso il Fondo belga per la Ricerca Scientifica.
Materials
| Reagent/Material | |||
| NaCl | Sigma – Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma – Aldrich | S8875 | |
| KCl | Sigma – Aldrich | P9333 | |
| D-glucose | Sigma – Aldrich | G7528 | |
| NaH2PO4 | Sigma – Aldrich | S9638 | |
| MgSO4 1M | Sigma – Aldrich | 63126 | |
| CaCl2 | Sigma – Aldrich | C4901 | |
| Carbogen | Air Liquide (Belgium) | ||
| Capillaries | WPI, Inc. (UK) | TW150-4 | |
| Stimulating Electrodes | FHC (USA) | CE2B30 | |
| Surgical tools | FST (Germany) | ||
| Filter paper 84 g/m2 | Sartorius | FT-3-105-110 | |
| Mesh | Lycra | 15 den | |
| Glue | UHU | plus endfest300 | |
| Instrument | |||
| Amplifier | WPI, Inc. (UK) | ISO-80 | |
| Interface recording chamber | FST (Germany) | ||
| Peristaltic pumps | Gilson (USA) | Minipuls 3 | |
| Temperature controller | University of Edinburgh | www.etcsystem.com | |
| Tissue Chopper | Mcllwain | ||
| Stimulators | Grass (USA) | S88X + SIU-V | |
| Program analysis | WinLTP | www.winltp.com | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 and MMO-220A | |
| Surgical microscope | Leica Microsystem | ||
| A/D converter | National Instruments | NIPCI-6229 M-series |
Riferimenti
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