الأداة المساعدة لمرحلة محددة في منتصف إلى أواخر<em> ذبابة الفاكهة</em> جريب عزل
Summary
العزلة مرحلة محددة من منتصف إلى أواخر بصيلات ذبابة الفاكهة مفيد لمجموعة متنوعة من الأغراض. مثل بصيلات تطوير في الثقافة، والذي يسمح للتلاعب الجيني و / أو الدوائية أن تقترن في المختبر فحوصات التنمية والتصوير الحي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام بصيلات للدراسات الجزيئية، مثل عزل مرنا والبروتين.
Abstract
ذبابة الفاكهة oogenesis أو تطوير جريب وقد استخدم على نطاق واسع للمضي قدما في فهم العمليات البيولوجية التنموية والخلايا المعقدة. وتصف هذه الورقة أساليب كيفية عزل بصيلات مرحلة منتصف إلى أواخر (المرحلة 10B-14) والاستفادة منها لتقديم رؤى جديدة في الأحداث الجزيئية والمورفولوجية التي تحدث خلال نوافذ ضيقة من الوقت التنموية. بصيلات معزولة يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من أساليب فنية تجريبية، بما في ذلك في المختبر فحوصات التنمية، التصوير الحية، وتحليل مرنا التعبير وتحليل لطخة غربية البروتينات. سوف بصيلات في المرحلة 10B (S10B) أو في وقت لاحق استكمال التطوير في الثقافة، وهذا يسمح لأحد أن الجمع بين اضطرابات وراثية أو دوائية مع تطوير في المختبر لتحديد الآثار المترتبة على مثل هذه التلاعبات على العمليات التي تحدث خلال فترات محددة من التنمية. بالإضافة إلى ذلك، لأن هذه المسام تطوير في الثقافة، هي مناسبة بشكل مثالي لأنها دراسات التصوير الحي، والتي غالبا ما تكشف عن آليات جديدة التي تتوسط الأحداث المورفولوجية. ويمكن أيضا أن تستخدم بصيلات معزولة عن التحليلات الجزيئية. على سبيل المثال، والتغيرات في التعبير الجيني التي تنجم عن الاضطرابات الوراثية يمكن تعريف للنوافذ التنموية المحددة. بالإضافة إلى ذلك، ومستوى البروتين، والاستقرار، و / أو تعديل ما بعد النقل الدولة خلال مرحلة معينة من التنمية جريب يمكن فحص من خلال تحليل لطخة غربية. وبالتالي، والعزلة مرحلة محددة من بصيلات ذبابة الفاكهة يوفر مصدرا غنيا للمعلومات في عمليات الحفاظ على نطاق واسع للتنمية والتشكل.
Introduction
ويتكون كل من المبيض ذبابة الفاكهة ~ 16 ovarioles، أو سلاسل من بالتتابع تستحق غرف البيض أو بصيلات. ويتكون كل جريب من بويضة واحدة، 15 خط الجرثومية المستمدة ممرضة أو دعم الخلايا، والخلايا الجسدية ~ 650 تسمى خلايا بصيلات (الشكل 1A). ينقسم ذبابة الفاكهة oogenesis إلى 14 مراحل محددة شكليا التنمية 1. ويلاحظ كل مرحلة من مراحل التنمية جريب عدة مرات ضمن ذبابة واحدة، مما يجعل من السهل نسبيا لعزل عدد كبير من بصيلات مرحلة محددة.
في منتصف إلى أواخر مراحل oogenesis (مراحل 10B-14) بشكل خاص مناسبة تماما للمرحلة العزلة (الشكل 1). في المرحلة 10B (S10B)، هو ممدود بصيلات بالكامل (أي طوله يساوي ذلك من المرحلة 14 (S14) جريب، انظر الشكل 1 والشكل 2H) ويتكون نصف طول المسام من خلايا ممرضةفي حين أن النصف الآخر هو البويضة (الشكل 1C). في هذه المرحلة الخضوع لخلايا ممرضة مثيرة الأكتين إعادة عرض، وتعزيز الأكتين القشرية وتوليد حزم متوازية من خيوط الأكتين 2. في الوقت نفسه، يبلغ عدد سكانها خلايا بصيلات، ووصف الخلايا الجاذبية، تهاجر بين الخلايا ممرضة والبويضة، ومجموعتين من الخلايا الظهرية جريب تصبح محددة للخضوع الهجرة لتشكيل الزوائد الظهرية والأجهزة التنفسية أنبوبي لالجنين 3 . الخلايا ممرضة ثم العقد (S11)، والضغط محتوياتها حشوية إلى البويضة في عملية تسمى خلية ممرضة الإغراق، والتي تنص على البويضة مع العوامل اللازمة لذلك لاستكمال مرحلة التطور الجنيني (1D الشكل). الخلايا ممرضة ثم الخضوع لموت الخلايا (S12-S13) 4، وتفرز خلايا بصيلات ونمط قشر البيض 5 (أرقام 1E-G). وهكذا، فإن نهاية oogenesis غنية مع إنمائية هامةعمليات التخلق د.
بصيلات معزولة منتصف إلى أواخر مرحلة (S10B-S14) يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من الأغراض، بما في ذلك تحليل الجزيئي. على سبيل المثال، مرنا من بصيلات نظموا يمكن أن تكون معزولة عن RT-PCR، ميكروأري، أو تحليلات الحمض النووي الريبي وما يليها. هذا يسمح احد للنظر في التعبير الجيني داخل نافذة التنموية قصيرة، مع عدد قليل من أنواع الخلايا الحالية، وتحديد كيفية تغير التعبير الجيني عن طريق الاضطرابات إما دوائية أو وراثية. ويمكن أيضا أن تستخدم مرحلة العزلة للنظر في البروتينات بواسطة النشاف الغربية. مثل هذا التحليل مهم لأنه يسمح احد لقياس مستوى البروتين التعبير في البرية من نوع مقابل المسوخ في مراحل معينة. في حين يمكن للمرء أن استخدام مناعي يحلل لتحقيق نتائج مماثلة، الكمي لمضان هو أقل قوة بسبب المتطلبات الصارمة أن كل بكسل تكون ضمن مجموعة خطية من الكشف 6. بالإضافة إلى ذلك، قد يوفر تحليل لطخة غربية معلومات أخرى، مثل هذاو إذا تم تعديل البروتين posttranslationally أو ما يعبر عنه من الإسوي لصق محددة. ويمكن أيضا أن تستخدم مراحل معزولة لمزيد من تنقية البروتين، بما في ذلك تجزئة التحت خلوية أو coimmunoprecipitation.
ويمكن أيضا مرحلة محددة جريب العزلة استخدامها لفي المختبر فحوصات التنمية 7 و 8 الحية التصوير. ستواصل معزولة بصيلات S10B-S13 S14 لتطوير لفي وسائل الإعلام ثقافة بسيطة (انظر أدناه). من المهم أن نلاحظ أن بصيلات S10A لن تقدم من خلال خلية ممرضة الإغراق باستخدام الظروف الثقافة مناقشتها في هذه المخطوطة. وقد استخدمنا S10B في المختبر فحوصات التنمية لتحديد دور البروستاجلاندين، سواء دوائيا وراثيا، في تنظيم الأكتين إعادة عرض باستخدام خلية ممرضة الإغراق والتنمية للقراءة عموميات 7،9. وبالمثل، فإن مراحل لاحقة من التطور ويمكن أيضا أن تكون معزولة لتحديد آثار العلاجات الدوائية أو رجل الوراثيةipulations على عمليات معينة مثل الهجرة الجاذبية الخلية، الظهرية أطرافهم الهجرة / تشكيل 10، وموت الخلايا ممرضة. مثل هذه المقايسات يمكن استخدامها لأداء شاشات التفاعل المهيمنة أو المقايسات، على سبيل المثال، في حين تغاير الزيجوت لطفرات في PXT أو fascin وحده لن يكون له تأثير على S10B التنمية في المختبر، وبصيلات من heterozygotes المزدوجة خلية ممرضة المعرض إلقاء العيوب وكتلة في التنمية 9.
بالإضافة إلى ذلك، لأن S10B-13 يمكن أن تتطور في الثقافة، وجميع العمليات التي تحدث خلال هذه الفترة يمكن ملاحظة من قبل الحية التصوير. هذا التصوير لا يمكن أن يؤديها مجرد استخدام الضوء المرسل (إذا كان أحد لا يهتم إلا تغييرات في التشكل الإجمالي) أو مع المجهري متحد البؤر باستخدام الذباب المعدلة وراثيا معربا عن تحقيقات الفلورسنت أو بصيلات ملطخة الأصباغ التصوير الحي. يتم استخدام التصوير الحي للمضي قدما إلى حد كبير فهمنا من العمليات التنموية. في الواقع، تخيل العيشز من بصيلات مرحلة متأخرة توسعت المعرفة الهجرة الظهرية أطرافهم، مثالا tubulogenesis 10. ونحن نتوقع أن تصوير حي لعمليات مرحلة متأخرة إضافية، بما في ذلك ديناميات الأكتين خلال خلية ممرضة الإغراق، وتقديم رؤى جديدة في هذه الأحداث التنموية. من المهم أن نلاحظ أنه في حين سوف S10A والمراحل الأولى من التنمية جريب لا تزال تتطور لتصبح S14 في الثقافة، ويعيش التصوير من الأحداث التي وقعت خلال تلك المراحل للتنمية هو ممكن باستخدام ظروف ثقافة بديلة 11-14 (انظر مناقشة لمزيد من المعلومات).
هنا نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لعزل بصيلات مرحلة متأخرة لأي تطوير في المختبر والعيش التصوير، أو التحليلات الجزيئية (مرنا والبروتين العزلة).
Protocol
Representative Results
Discussion
وتتكون بصيلات ذبابة الفاكهة فقط عدد قليل من أنواع الخلايا، مما يجعلها مثالية لكلا المورفولوجي والتحليلات الجزيئية. وعلاوة على ذلك، ونظرا لهيكل المبيض، فمن السهل نسبيا الحصول على أعداد كبيرة من مراحل محددة للتنمية جريب مع نطاق تشريح المشتركة والحد الأدنى من ال?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر توماس Lecuit (SQH-Utrophin :: خط GFP)، ومركز بلومنجتون المالية، والدراسات هجين البنك التنموي للمواد. نشكر كذلك جميع أعضاء مختبر بوق للمناقشات وانتقادات مفيدة للمخطوطة. بتمويل من المؤسسة الوطنية للعلوم الأموال بدء من قسم التشريح وبيولوجيا الخلية MCB-1158527، وجامعة ولاية ايوا أيد هذا العمل. المعاهد الوطنية للصحة دكتوراه مسبقا تدريب المنحة الدوائية العلوم T32GM067795 بدعم AJS. وقدم دعم تخزين البيانات عن طريق تكنولوجيا المعلومات والاتصالات، والتي يتم تمويلها من خلال CTSA بدعم من المركز الوطني لبحوث الموارد والمركز الوطني للنهوض بالحركة العلوم والمعاهد الوطنية للصحة، من خلال منحة UL1RR024979.
Materials
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | Any source of Active Dry Yeast is fine |
| Grace’s Insect Media | Lonza | 04-457F | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | Any Heat Inactivated FBS should work |
| 10x Pen/Strep | Gibco/Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises and Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Spot Plate, Nine Well | Corning | 7220-85 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 24 multi-well plates | Becton Dickinson | 35 3226 | Any 24-well tissue culture dish should work |
| Coverslip Bottom Dishes (35mm) | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used |
| Glass pipettes | Corning | 7095B-5x (for transferring follicles) | |
| Glass pipettes – long | Corning | 7095B-9 (for producing pulled pipettes) | |
| Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free) | Research Products International | 199228 | Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
Riferimenti
- Spradling, A. C., Bate, M., Martinez-Arias, A. . The development of Drosophila melanogaster. , 1-70 (1993).
- Guild, G. M., Connelly, P. S., Shaw, M. K., Tilney, L. G. Actin filament cables in Drosophila nurse cells are composed of modules that slide passively past one another during dumping. J. Cell Biol. 138, 783-797 (1997).
- Horne-Badovinac, S., Bilder, D. Mass transit: epithelial morphogenesis in the Drosophila egg chamber. Dev. Dyn. 232, 559-574 (2005).
- McCall, K. Eggs over easy: cell death in the Drosophila ovary. Dev. Biol. 274, 3-14 (2004).
- Berg, C. A. The Drosophila shell game: patterning genes and morphological change. Trends Genet. 21, 346-355 (2005).
- Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry–issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2006).
- Tootle, T. L., Spradling, A. C. Drosophila Pxt: a cyclooxygenase-like facilitator of follicle maturation. Development. 135, 839-847 (2008).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
- Groen, C. M., Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Tootle, T. L. Drosophila Fascin is a novel downstream target of prostaglandin signaling during actin remodeling. Mol. Biol. Cell. 23, 4567-4578 (2012).
- Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. Dev. Biol. 267, 320-341 (2004).
- Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Dev. Cell. 12, 997-1005 (2007).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, 2207-2215 (2011).
- Bianco, A., et al. Two distinct modes of guidance signalling during collective migration of border cells. Nature. 448, 362-365 (2007).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Kelso, R. J., et al. Flytrap, a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 32, 418-420 (2004).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetica. 175, 1505-1531 (2007).
- Tootle, T. L., Williams, D., Hubb, A., Frederick, R., Spradling, A. Drosophila eggshell production: identification of new genes and coordination by Pxt. PLoS. One. 6, e19943 (2011).
- Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
