Exame<em> Drosophila</em> Larval células terminais traqueais por microscopia de luz
Summary
Aqui, apresentamos um método para análise de microscopia de luz das células terminais traqueal em<em> Drosophila</em> Larvas. Este método permite uma análise rápida do ramo lumen e morfologia em animais inteiros e seria útil para a análise dos mutantes individuais ou ecrãs de mutações que afectam o desenvolvimento das células do terminal.
Abstract
Forma celular é crítico para a função celular. No entanto, apesar da importância da morfologia celular, pouco é conhecido sobre as células individuais como gerar formas específicas. Células terminais traqueais Drosophila tornaram-se um modelo genético poderosa para identificar e elucidar os papéis dos genes necessários para a geração de morfologias celulares. Células de terminais são um componente de uma rede tubular ramificada, o sistema traqueal que funciona de modo a fornecer oxigénio aos tecidos internos. Células de terminais são um excelente modelo para investigar questões de forma da célula que possuam duas arquitecturas celulares distintas. Primeiro, as células terminais têm uma morfologia ramificado elaborado, semelhante aos neurónios complexos, em segundo lugar, os ramos celulares terminais são formadas como tubos finos e contêm um lúmen ligada à membrana intracelular. A análise quantitativa do número de células ramo terminal, organização ramo e forma ramo individual, pode ser usado para fornecer informações sobre o papel do mecanismo genético específicomos na confecção de uma célula ramificada. Análise de formação de tubos nestas células pode revelar os mecanismos conservadas do tubulogenesis comuns a outras redes tubulares, tais como a vasculatura vertebrado. Aqui, descrevem técnicas que podem ser usadas para corrigir rapidamente, imagem e analisar os padrões de ramificação e em células de formação de tubo de terminal dentro larvas de Drosophila. Estas técnicas podem ser utilizadas para analisar as células terminais em animais de tipo selvagem e mutante, ou mosaicos genéticos. Devido à elevada eficiência deste protocolo, é também adequada para genético, baseado RNAi, ou telas da droga no sistema de Drosophila traqueal.
Introduction
Forma celular é crítico para a função das células individuais dentro de um organismo, bem como células que funcionam como parte de um tecido ou órgão. Nós usamos células terminais de Drosophila traqueais, um componente do sistema respiratório de insetos, para investigar os mecanismos moleculares que participam no controle de dois tipos conservados de morfologia celular: Desvios e formação do tubo (lumenogenesis). Células terminais estão localizadas nas pontas de uma rede de tubos ramificados que funciona para fornecer oxigénio aos tecidos internos 1 e têm uma morfologia ramificado elaborado, que depende de uma via de sinalização do FGF, que é controlado por níveis de oxigénio dentro dos tecidos locais-alvo 2. Ramos terminais celulares são tubos finos, com cheias de gás lúmen subcelulares que atravessam cada ramo. As arquitecturas celulares distintas de células de terminal, juntamente com a facilidade através da qual a análise genética pode ser realizada em Drosophila, tornar essas células um modelo excelente fou investigar os mecanismos de crescimento celular, a ramificação, e a formação do tubo intracelular. Células Terminal provaram um modelo útil para compreender algumas das vias de sinalização que levam à diferenciação de células ramificadas, conseqüência, e maturação 2-4. Usando este sistema imparcial, telas para a frente genéticos para mutantes morfogênese celular foram realizados, gerando insights sobre os mecanismos que controlam a forma da célula 5,6. Por exemplo, estas telas tenham revelado que um RabGAP específico é necessário para a polaridade do citoesqueleto e o tráfico de vesículas na formação de lúmen e de posicionamento 7, que a adesão mediada pela integrina é necessária para a estabilidade do ramo 8, e que as proteínas de PAR-polaridade epiteliais regular tráfico membrana polarizado necessário tanto para a ramificação e formação de lúmen 9. Outros estudos em células de terminais têm mostrado que a acumulação de actina assimétrica e organização de microtúbulos é necessária para o alongamento das células e lumenogenesis <saté> 10. Assim, diversos mecanismos biológicos, células conservadas contribuir para a morfogénese do terminal da célula.
Aqui, descrevemos um método para corrigir rapidamente as larvas Drosophila terceiro instar intacto para análise de células ramificação terminal e formação de lúmen. Este protocolo pode também ser efectuada em ambos os primeiro e segundo instar animais. A chave para esta técnica é a capacidade de visualizar as células terminais que estão geneticamente marcadas através da expressão da proteína fluorescente directamente através da cutícula larval de animais intactos. Uma vez que este procedimento não requer quaisquer manipulações pós-fixação, tais como a coloração do anticorpo, para observar as células, que é bem adequado à análise de alto rendimento, incluindo o rastreio genético ou fármaco. A expressão da proteína fluorescente que revela a estrutura dos ramos cheias de citoplasma. Formação do tubo pode ser controlado em paralelo utilizando microscopia de campo claro para identificar o lúmen cheio de gás, o que contrasta com o ambiente fluido enchatecidos ed.
Incluído neste protocolo é o método para a geração de mosaicos genéticos baseados no sistema MARCM 11, para produzir as células terminais mutantes homozigotos marcadas com proteínas fluorescentes em animais unlabeled contrário. Isto é necessário, uma vez que as células terminais só elaborar suas estruturas complexas relativamente tarde no desenvolvimento; mosaicos genéticos permitem a derivação de requisitos de genes em outros tecidos anteriores em desenvolvimento. . Gerar clones MARCM, traquéia são rotulados usando o driver específico-traqueal sem fôlego (BTL) 12 aqui descrito é o protocolo para o cromossomo X Drosophila, por outros cromossomos, um procedimento semelhante pode ser usado, com reagentes genético apropriado para o cromossoma ser examinados. Aqui, a traqueia são rotulados por expressão de uma GFP citoplasmaticamente localizada, mas o procedimento funciona igualmente bem com a expressão de outras proteínas fluorescentes, tais como DsRed.
Além disso, nós incluímos um método para quantificar os padrões de ramificação e formação de lúmen em células de terminais, com base em métodos desenvolvidos para a caracterização de padrões de ramificação neuronal 13. Este tipo de dados quantitativos pode ser crítico para discernir o papel exacto de genes no processo de ramificação ou lumenogenesis, bem como permitindo comparações directas entre diferentes mutantes 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
A técnica de fixação calor aqui descrito é uma ferramenta rápida e conveniente para as células terminais traqueais imagem Drosophila larvas. Aqui, podemos utilizar esta técnica para examinar o padrão de ramificação e do lúmen de células do tipo selvagem. Células de traquéia expressando GFP, impulsionada pelo promotor específico traqueal fôlego, pode ser facilmente visualizado através da cutícula larval após a fixação de calor. Os padrões de ramificação específicos de células i…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Gillian Stanfield para comentários sobre o manuscrito. TAJ é apoiado pela Universidade de Utah Genetics Training Grant T32-GM007464 do NIH NIGMS.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotype: y w FRT19A |
Riferimenti
- Manning, G., Krasnow, M. A. Development of the Drosophila Tracheal System. The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).
- Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF. Cell. 99 (2), 211-220 (1999).
- Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis. Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).
- Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation. PLoS ONE. 7 (9), e45649 (2012).
- Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system. PLoS Genetics. 7 (7), e1002087 (2011).
- Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila. Genetica. 176 (4), 2279-2291 (2007).
- Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth. Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).
- Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization. Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).
- Jones, T. A., Metzstein, M. M. A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster. Genetica. 189 (1), 153-164 (2011).
- Gervais, L., Casanova, J. In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell. Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. A nuclear GFP/ß-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila. Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).
- Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -. C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting. Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).
