Onderzoek van<em> Drosophila</em> Larvale Tracheale Terminal cellen door lichtmicroscopie

Summary

Hier presenteren we een methode voor lichtmicroscopie analyse van tracheale terminal cellen in<em> Drosophila</em> Larven. Deze methode zorgt voor een snelle behandeling van de tak en lumen morfologie in hele dieren en bruikbaar voor de analyse van individuele mutanten of schermen voor mutaties die terminale cel ontwikkeling zou zijn.

Abstract

Cel vorm is van cruciaal belang voor de celfunctie. Echter, ondanks het belang van de cel morfologie, is weinig bekend over hoe individuele cellen te genereren specifieke vormen. Drosophila tracheale terminal cellen een krachtig genetisch model te identificeren en verhelderen van de rollen van genen die nodig zijn voor het genereren van cellulaire morfologie zijn geworden. Terminal cellen zijn een onderdeel van een vertakte buisvormige netwerk, de tracheale systeem dat functioneert zuurstof naar interne weefsels. Terminale cellen zijn een uitstekend model voor het onderzoeken van de vragen van de cel vorm als ze beschikken over twee verschillende cellulaire architecturen. Eerste, terminale cellen hebben een uitgebreid vertakte morfologie, vergelijkbaar met complexe neuronen, ten tweede, zijn terminal cel takken gevormd als dunne buizen en bevatten een membraan-gebonden intracellulaire lumen. Kwantitatieve analyse van terminale cellen filiaalnummer, branch organisatie als filialen vorm, kan worden gebruikt om informatie over de rol van specifieke genetische mech biedennismen in het maken van een vertakte cel. Analyse van buisvorming in deze cellen kan onthullen geconserveerde mechanismen tubulogenesis bij andere buisvormige netwerken, zoals de vertebraat vaatstelsel. Hier beschrijven we technieken die kunnen worden gebruikt om snel oplossen, beeld en analyseren zowel vertakkingspatronen en vaatvorming in terminal cellen in Drosophila larven. Deze technieken kunnen worden gebruikt om cellen te analyseren terminal in wild-type en mutante dieren of genetische mozaïeken. Vanwege het hoge rendement van dit protocol, is het ook zeer geschikt voor genetische, RNAi-gebaseerde, of drug-schermen in het Drosophila tracheale systeem.

Introduction

Celvorm is cruciaal voor de functie van afzonderlijke cellen in een organisme, alsook cellen die als onderdeel van een weefsel of orgaan. We gebruiken Drosophila tracheale cellen terminal, een component van het insect luchtwegen, de moleculaire mechanismen die aan de controle twee geconserveerde types van cellulaire morfologie onderzoeken: vertakking en buisvorming (lumenogenesis). Terminal cellen zich aan de uiteinden van een netwerk van vertakte buizen die functies zuurstof aan interne weefsels ¹ en hebben een uitgebreide vertakte morfologie die afhangt van een FGF signaling pathway die wordt bestuurd door de lokale zuurstofconcentratie in doelweefsels ^2. Terminale cel takken zijn dunne buisjes, met een gasgevulde subcellulaire lumen loopt door elke tak. De van cellulaire architectuur van terminale cellen, samen met het gemak waarmee genetische analyse kan worden uitgevoerd in Drosophila, maken deze cellen een uitstekend model fof onderzoeken van mechanismen van cellulaire uitgroei, vertakking, en intracellulaire buis formatie. Terminale cellen hebben een bruikbaar model voor het begrijpen van een aantal van de signaalwegen die leiden tot vertakte celdifferentiatie, uitgroei en rijping ^2-4 bewezen. Met behulp van dit systeem onpartijdige, zijn forward genetische schermen voor mobiele morfogenese mutanten uitgevoerd, waardoor inzicht in mechanismen die de cel vorm ^5,6. Zo hebben deze schermen gebleken dat een bepaald RabGAP vereist voor cytoskelet polariteit en vesicle handel in lumen vorming en positionering ^7, dat integrine-gemedieerde hechting vereist voor branch stabiliteit ^8, en die PAR-epitheliale polariteit eiwitten reguleren gepolariseerde membraantransport vereist zowel vertakking en lumen vorming ^9. Andere studies in terminal cellen hebben aangetoond dat asymmetrische actine accumulatie en microtubuli organisatie is nodig voor cel-rek en lumenogenesis <sup> 10. Zo divers, geconserveerde celbiologische mechanismen bijdragen tot terminale cel morfogenese.

Hier beschrijven we een methode om snel te repareren intact derde instar Drosophila larven voor de analyse van de terminal cel vertakking en lumen vorming. Dit protocol kan ook worden uitgevoerd op zowel eerste als tweede instar dieren. Sleutel tot deze techniek is de mogelijkheid om terminal cellen die genetisch gemerkt door fluorescerend eiwit expressie rechtstreeks via de larvale cuticula van intacte dieren te visualiseren. Aangezien deze procedure vereist geen post-fixatie manipulaties, zoals antilichaam kleuring, de cellen nemen, is het geschikt voor hoge doorvoer analyse, waaronder genetische of drug screening. Fluorescent eiwitexpressie toont de structuur van het cytoplasmatisch gevulde takken. De buisvorming kan worden gecontroleerd parallel met helderveld microscopie gas gevulde lumen, die afwijkt van de omringende vloeistof-vul identificerened weefsels.

Inbegrepen in dit protocol is de methode voor het genereren van genetische mozaïeken gebaseerd op het marcm systeem ^11, om homozygote mutant terminal cellen gelabeld met fluorescerende eiwitten in andere niet-gemerkte dieren produceren. Dit is nodig, omdat terminal cellen alleen werken hun complexe structuren relatief laat in de ontwikkeling; genetische mozaïeken zorgen voor bypass van gen-eisen in andere weefsels eerder in ontwikkeling. . Om marcm klonen te genereren, zijn luchtpijp geëtiketteerd met de tracheale-specifieke driver ademloos (BTL) ¹² Beschreven hier is het protocol voor de Drosophila X-chromosoom, voor andere chromosomen, kan een soortgelijke procedure worden toegepast, met genetische reagentia geschikt om het chromosoom zijn onderzocht. Hier trachea worden gelabeld door expressie van een cytoplasmatisch gelokaliseerde GFP, maar de procedure werkt even goed met de expressie van andere fluorescerende eiwitten, zoals DsRed.

Daarnaast hebben we een methode vertakkingspatronen en vorming lumen kwantificeren terminal cellen, gebaseerd op technieken ontwikkeld voor de karakterisering van neuronale branch patronen ^13. Dit soort van kwantitatieve data kan kritisch zijn in het onderscheiden van de precieze rol van genen in de vertakking of lumenogenesis proces evenals waardoor directe vergelijkingen tussen verschillende mutanten ^9.

Protocol

1. Mozaïek Generation Genetische Cross w FRT 19A bad: GAL80 FLP 122 / Y; Btl-GAL4, UAS-GFP (mannetjes) X * FRT 19A / Bal (vrouwtjes), waarbij * de mutant te worden onderzocht. Opmerking: Stel voorafgaand aan experiment ten minste een dag, omdat dit mogelijk maken de dieren adequaat te paren. Pre-lay: Transfer kruis te vliegen-food flesjes met een klein uitstrijkje van verse gist pasta geplaatst op d…

Representative Results

Resultaten worden getoond in Figuur 2. Een laterale groep (LG) terminal cel geeft uitgebreide subcellulair vertakking (gevisualiseerd door GFP, A) en een gas-gevulde subcellulaire lumen die door elk van de takken (gevisualiseerd door helderveld microscopie, B). Deze beelden werden verzameld uit een mozaïek L3 larve, gegenereerd met behulp van het marcm systeem in de paragrafen 1 en 2 beschreven, en de warmte vast en afgebeeld, zoals beschreven in de hoofdstukken 3 en 4. Panelen C & D tonen een Neur…

Discussion

De thermofixatie hier beschreven techniek is een snel en handig hulpmiddel voor beeldvorming Drosophila larven tracheale terminale cellen. Hier gebruiken we deze techniek de vertakking en lumen patroon van wildtype cellen onderzocht. Tracheale cellen die GFP, gedreven door de tracheale specifieke promotor ademloos, kan eenvoudig worden gevisualiseerd door het larvale cuticula na thermofixatie. De specifieke vertakking patronen van afzonderlijke terminal cellen, evenals die van de met lucht gevulde lume…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Student Dumont #5 forceps	Fine Scientific Tools	91150-20
Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent)	Leica	MZ16
AxioImager M1 compound microscope (or equivalent)	Carl Zeiss		Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE
100% Glycerol	BioExpress	M152-4L
Fly stock			Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A
Fly stock			Genotype: y w FRT19A