की परीक्षा<em> ड्रोसोफिला</emलाइट माइक्रोस्कोपी द्वारा> लारवल Tracheal टर्मिनल प्रकोष्ठों
Summary
यहाँ, हम सांस की नली टर्मिनल कोशिकाओं के प्रकाश माइक्रोस्कोपी विश्लेषण में के लिए एक विधि प्रस्तुत<em> ड्रोसोफिला</em> लार्वा. यह विधि पूरी पशुओं में शाखा और लुमेन आकारिकी की त्वरित जांच के लिए अनुमति देता है और व्यक्तिगत म्यूटेंट या टर्मिनल सेल विकास को प्रभावित करने वाले परिवर्तन के लिए स्क्रीन के विश्लेषण के लिए उपयोगी होगा.
Abstract
सेल आकार सेल समारोह के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, सेल आकारिकी के महत्व के बावजूद, छोटे व्यक्ति की कोशिकाओं के विशिष्ट आकार उत्पन्न कैसे के बारे में जाना जाता है. ड्रोसोफिला सांस की नली टर्मिनल कोशिकाओं सेलुलर morphologies पैदा करने के लिए आवश्यक जीन की भूमिका की पहचान करने और स्पष्ट करने के लिए एक शक्तिशाली आनुवंशिक मॉडल बन गए हैं. टर्मिनल कोशिकाओं एक branched ट्यूबलर नेटवर्क का एक घटक, आंतरिक ऊतकों को ऑक्सीजन की आपूर्ति के लिए कार्य करता है कि सांस की नली व्यवस्था कर रहे हैं. टर्मिनल कोशिकाओं वे दो अलग सेलुलर आर्किटेक्चर के अधिकारी के रूप में सेल आकार के सवालों की जांच के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल हैं. सबसे पहले, टर्मिनल कोशिकाओं जटिल न्यूरॉन्स के लिए इसी तरह की एक विस्तृत शाखायुक्त आकारिकी, है, दूसरा, टर्मिनल सेल शाखाओं पतली ट्यूब के रूप में गठन और एक झिल्ली ही सीमित इंट्रासेल्युलर लुमेन होते रहे हैं. टर्मिनल सेल शाखा संख्या, शाखा संगठन और व्यक्ति शाखा आकार, के मात्रात्मक विश्लेषण विशिष्ट आनुवंशिक यांत्रिक की भूमिका के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैएक branched सेल के निर्माण में anisms. इन कोशिकाओं में ट्यूब गठन के विश्लेषण से इस तरह कशेरुकी वाहिका संरचना के रूप में अन्य ट्यूबलर नेटवर्क के लिए आम tubulogenesis के संरक्षित तंत्र, प्रकट कर सकते हैं. यहाँ हम तेजी, छवि को ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि तकनीक का वर्णन है, और ड्रोसोफिला लार्वा के भीतर दोनों शाखाओं में बंटी पैटर्न और टर्मिनल कोशिकाओं में ट्यूब गठन का विश्लेषण. इन तकनीकों में जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती पशुओं, या आनुवंशिक मोज़ाइक में टर्मिनल कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. क्योंकि इस प्रोटोकॉल की उच्च क्षमता की, यह भी अच्छी तरह से आनुवंशिक, आरएनएआई आधारित, या ड्रोसोफिला सांस की नली प्रणाली में दवा स्क्रीन के लिए अनुकूल है.
Introduction
सेल आकार एक जीव के भीतर व्यक्ति की कोशिकाओं के समारोह के लिए महत्वपूर्ण है, साथ ही कोशिकाओं है एक ऊतक या अंग के हिस्से के रूप में उस समारोह. शाखाओं में बंटी और ट्यूब गठन (lumenogenesis): हम सेलुलर आकारिकी की दो संरक्षित प्रकार नियंत्रित करने में भाग लेने कि आणविक तंत्र की जांच करने के लिए ड्रोसोफिला सांस की नली टर्मिनल कोशिकाओं, कीट श्वसन प्रणाली के एक घटक, का उपयोग करें. टर्मिनल कोशिकाओं शाखायुक्त ट्यूबों के एक नेटवर्क के सुझावों पर स्थित हैं कि आंतरिक ऊतकों 1 को ऑक्सीजन देने और लक्ष्य ऊतकों 2 के भीतर स्थानीय ऑक्सीजन के स्तर के द्वारा नियंत्रित किया जाता है कि एक FGF संकेतन मार्ग पर निर्भर करता है जो एक विस्तृत शाखायुक्त आकारिकी है के लिए काम करता है. टर्मिनल सेल शाखाओं प्रत्येक शाखा के माध्यम से चल रहे गैस से भरे subcellular लुमेन के साथ, पतली ट्यूब हैं. आनुवांशिक विश्लेषण ड्रोसोफिला में प्रदर्शन किया जा सकता है जिसके द्वारा आसानी के साथ टर्मिनल कोशिकाओं के विशिष्ट सेलुलर आर्किटेक्चर, इन कोशिकाओं को एक शानदार मॉडल च बनानाया, सेलुलर परिणाम के तंत्र की जांच शाखाओं, और intracellular ट्यूब गठन. टर्मिनल कोशिकाओं शाखायुक्त सेल भेदभाव, परिणाम, और परिपक्वता 2-4 करने के लिए अग्रणी संकेत दे रास्ते के कुछ समझने के लिए एक उपयोगी मॉडल साबित कर दिया है. इस प्रणाली निष्पक्ष प्रयोग, सेल morphogenesis म्यूटेंट के लिए आगे आनुवंशिक स्क्रीन सेल आकार 5,6 नियंत्रित तंत्र में अंतर्दृष्टि उपज प्रदर्शन किया गया है. इंटीग्रिन की मध्यस्थता आसंजन शाखा स्थिरता 8 के लिए आवश्यक है कि, उदाहरण के लिए, इन स्क्रीन एक विशिष्ट RabGAP लुमेन गठन और पोजीशनिंग 7 में cytoskeletal polarity और पुटिका तस्करी के लिए आवश्यक है कि पता चला है और कि उपकला बराबर ध्रुवता प्रोटीन की आवश्यकता ध्रुवीकृत झिल्ली तस्करी को विनियमित शाखाओं में बंटी और लुमेन गठन 9 दोनों के लिए. टर्मिनल कोशिकाओं में अन्य अध्ययनों असममित actin के संचय और microtubule संगठन सेल बढ़ाव और lumenogenesis के लिए आवश्यक है कि पता चला है <s> 10 ऊपर. इस प्रकार, विविध, संरक्षित सेल जैविक तंत्र टर्मिनल सेल morphogenesis में योगदान.
यहाँ, हम तेजी से टर्मिनल सेल शाखाओं में बंटी और लुमेन गठन के विश्लेषण के लिए बरकरार तीसरे instar ड्रोसोफिला लार्वा को ठीक करने के लिए एक विधि का वर्णन है. इस प्रोटोकॉल भी पहले और दूसरे दोनों instar जानवरों पर किया जा सकता है. इस तकनीक की कुंजी आनुवंशिक सीधे बरकरार जानवरों का लार्वा छल्ली के माध्यम से फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित कर रहे हैं कि टर्मिनल कोशिकाओं कल्पना करने की क्षमता है. इस प्रक्रिया ऐसी एंटीबॉडी धुंधला के रूप में किसी भी पद के निर्धारण जोड़तोड़, कोशिकाओं का पालन करने की आवश्यकता नहीं है, यह अच्छी तरह से आनुवंशिक या दवा स्क्रीनिंग सहित, उच्च throughput विश्लेषण के लिए अनुकूल है. फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति cytoplasmically से भरे शाखाओं की संरचना का पता चलता है. ट्यूब गठन के समानांतर आसपास के तरल पदार्थ भरने के साथ विरोधाभासों जो गैस से भरे लुमेन, की पहचान करने के लिए brightfield माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर में नजर रखी जा सकतीएड ऊतकों.
इस प्रोटोकॉल में शामिल अन्यथा unlabeled पशुओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल समयुग्मक उत्परिवर्ती टर्मिनल कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए MARCM प्रणाली 11 के आधार पर आनुवंशिक मोज़ाइक पैदा करने के लिए विधि है. टर्मिनल कोशिकाओं केवल अपेक्षाकृत देर से विकास में उनके जटिल संरचनाओं प्रकाश डालेंगे, क्योंकि यह आवश्यक है, आनुवंशिक मोज़ाइक पहले के विकास में अन्य ऊतकों में जीन आवश्यकताओं के बाईपास के लिए अनुमति देते हैं. . MARCM क्लोन उत्पन्न करने के लिए, श्वासनली यहाँ वर्णित बेदम सांस की नली विशेष ड्राइवर (BTL) 12 का उपयोग कर चिह्नित कर रहे हैं ड्रोसोफिला एक्स गुणसूत्र के लिए प्रोटोकॉल है, दूसरे क्रोमोसोम के लिए, एक इसी तरह की प्रक्रिया की जा रही गुणसूत्र के लिए उपयुक्त आनुवंशिक अभिकर्मकों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है जांच की. इधर, श्वासनली एक cytoplasmically स्थानीयकृत GFP की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित कर रहे हैं, लेकिन प्रक्रिया ऐसी dsRed के रूप में अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के साथ समान रूप से अच्छी तरह से काम करता है.
इसके अतिरिक्त, हम न्यूरोनल शाखा पैटर्न 13 निस्र्पक के लिए विकसित की विधियों पर आधारित है, टर्मिनल कोशिकाओं में शाखाओं में बंटी पैटर्न और लुमेन गठन यों के लिए एक विधि को शामिल किया है. मात्रात्मक डेटा के इस तरह समझदार सटीक शाखाओं या lumenogenesis प्रक्रिया में जीन की भूमिका, साथ ही विभिन्न म्यूटेंट 9 के बीच प्रत्यक्ष तुलना के लिए अनुमति देने में महत्वपूर्ण हो सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ वर्णित गर्मी निर्धारण तकनीक इमेजिंग ड्रोसोफिला लार्वा सांस की नली टर्मिनल कोशिकाओं के लिए एक तेजी से और सुविधाजनक उपकरण है. यहाँ, हम शाखाओं और जंगली प्रकार की कोशिकाओं के लुमेन पैटर्न की जांच…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए गिलियन Stanfield धन्यवाद. ताज एनआईएच NIGMS से यूटा जेनेटिक्स प्रशिक्षण अनुदान T32-GM007464 विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotype: y w FRT19A |
Riferimenti
- Manning, G., Krasnow, M. A. Development of the Drosophila Tracheal System. The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).
- Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF. Cell. 99 (2), 211-220 (1999).
- Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis. Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).
- Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation. PLoS ONE. 7 (9), e45649 (2012).
- Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system. PLoS Genetics. 7 (7), e1002087 (2011).
- Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila. Genetica. 176 (4), 2279-2291 (2007).
- Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth. Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).
- Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization. Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).
- Jones, T. A., Metzstein, M. M. A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster. Genetica. 189 (1), 153-164 (2011).
- Gervais, L., Casanova, J. In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell. Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. A nuclear GFP/ß-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila. Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).
- Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -. C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting. Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).
