在肌肉再生的老鼠模型中移植诱导多能干细胞衍生的中生代细胞样肌原体
Summary
诱导多能干细胞（iPSC）衍生的肌原祖是细胞治疗策略治疗肌肉营养不良的有希望的候选人。该协议描述了评估急性和慢性肌肉再生小鼠模型中 iPSC 衍生中生肌肉细胞（一种肌肉祖先）的移植和分化所需的移植和功能测量。
Abstract
患者衍生的iPSC可能是未来自体细胞治疗协议的宝贵细胞来源。iPSC 衍生的肌原干细胞/祖细胞类似于腹膜衍生的间质细胞（iPSC 衍生的中生代细胞（类似 IPSC 的干细胞/祖细胞：IDEMs）可以从受不同形式的肌肉营养不良患者产生的 iPSC 中建立。患者特异性IDEM可以通过不同的策略（如 扁桃体载体、人为染色体）进行基因校正，并在肌生成调节器MyoD过度表达后增强其肌原分化潜力。然后，通过特定的分化检测 在体外 评估这种致肌潜力，并通过免疫荧光进行分析。在显示急性和慢性肌肉再生的两个具有代表性的小鼠模型进行肌肉内和动脉内移植后，在 体内进一步评估IDEM的再生潜力。然后，在移植的小鼠中，不同的功能测试证实了IDEM对宿主骨骼肌肉的贡献。特别是，通过跑步机测试研究动物运动能力的改善。然后，通过对移植肌肉的一些组织学和免疫荧光检测来评估细胞的移植和分化。总的来说，本文描述了目前用于评估IDEM分化能力的检测方法和工具，重点是移植方法和后续结果措施，以分析细胞移植的功效。
Introduction
中生代细胞（MABs）是来自1-3个潜细胞子集的血管相关肌肉祖先。MAB比卫星细胞4 等规范性肌肉祖先的主要优势在于它们在动脉内传递时穿过血管壁的能力，从而有助于细胞治疗协议中的骨骼肌肉再生。这一特点已被评估和确认在肌肉萎缩症的穆林和犬模型1，5，6。这些临床前研究为基于杜琴肌肉营养不良儿童的捐赠者HLA相同MAB的动脉内移植（EudraCT 2011-000176-33;目前正在意大利米兰圣拉斐尔医院进行）的一人第一阶段I/II临床试验奠定了基础。细胞治疗方法的主要障碍之一是”药物产品”（细胞）的增殖潜力有限，需要数十亿个细胞来治疗整个身体的肌肉。此外，最近已经证明，不可能从受某些形式的肌肉营养不良症影响的患者那里获得MAB，因为它发生在肢体-腰肌营养不良2D（LGMD2D：奥米姆#608099）7.
为了克服这些限制，最近建立了一个协议，从人类和穆林iPSC中衍生出类似MAB的干细胞/祖细胞。这个过程产生容易膨胀的细胞群与血管基因特征和免疫嗜血型高度类似于成人肌肉衍生的MAB。在表达肌原调节因子MyoD时，穆林和人类IDEM（分别是MIDM和HIDEM）都会经历末期骨骼肌肉分化。为了实现这个目标，IDEM可以用能够驱动MyoD表达的载体进行转换，无论是构成还是以一种不可推断的方式8-10。使用含有肌激素受体（MyoD-ER）的扁桃体载体，从而允许其核转移后，塔莫西芬（雌激素模拟）管理11。这一策略导致形成富营养多核肌结核，具有高效率7。值得注意的是，IDEM是非肿瘤性的，移植后可以移植后在宿主肌肉内移植和分化，并且可以使用不同的载体（如 扁豆病毒或人类人工染色体）进行基因矫正，为未来的自体治疗策略铺平道路。上述出版物7中描述了IDEM的衍生、定性和移植。本协议文件详细说明了为评估IDEM的 体外 肌原分化而进行的检测以及随后的结果测量，以测试其移植在小鼠肌肉再生模型中的疗效。
Protocol
Representative Results
Discussion
iPSC可以无限期地扩展，同时保持其自我更新的潜力，从而被引导到广泛的细胞血统12。由于这个和其他原因，iPSC衍生的干细胞/祖细胞被认为是自体基因和细胞治疗方法13的有希望的来源。作者先前发表的一篇著作报告了iPSC中小鼠和人类肌原祖先的生成，其表型与围网衍生的MAB（IDEMs）相似，并在小鼠肌肉营养不良7模型中对肌肉再生的有效贡献。
最大…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢朱利奥·科苏、玛蒂娜·拉加齐和整个实验室的有益讨论和支持，感谢杰夫·张伯伦亲切地提供MyoD-ER载体。所有涉及活体动物的实验都是按照所有相关的监管和体制机构、条例和准则完成的。作者实验室的工作得到了英国医学研究理事会、欧洲共同体第七框架项目Optisem和Biodesign以及意大利杜尚家长项目的支持。
Materials
| REAGENTS | |||
| MegaCell DMEM | Sigma | M3942 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Horse serum | Euroclone | ECS0090L | |
| Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14801F | |
| PBS Calcium/Magnesium free | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutammine | Sigma | G7513 | |
| Penicilline/Streptomicin | Sigma | P0781 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| ITS (Insulin-Transferrin-Selenium) | Gibco | 51500-056 | |
| Non-essential amino acid solution | Sigma | M7145 | |
| Fer-In-Sol | Mead Johnson | ||
| Ferlixit | Aventis | ||
| Oleic Acid | Sigma | 01257-10 mg | |
| Linoleic Acid | Sigma | L5900-10 mg | |
| Human bFGF | Gibco | AA 10-155 | |
| Grow factors-reduced Matrigel | Becton Dickinson | 356230 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Sodium heparin | Mayne Pharma | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | HARMFUL |
| Patent blue dye | Sigma | 19, 821-8 | |
| EDTA | Sigma | E-4884 | |
| Paraformaldehyde | TAAB | P001 | HARMFUL |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| 4-OH Tamoxifen | Sigma | H7904 | |
| pLv-CMV-MyoD-ER(T) | Addgene | 26809 | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9759 | HARMFUL |
| Povidone iodine | |||
| Tragachant gum | MP biomedicals | 104792 | |
| Isopenthane | VWR | 24,872,323 | |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | |
| Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
| Polarized glass slides | Thermo | J1800AMNZ | |
| Eosin Y | Sigma | E4382 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Masson's trichrome | Bio-Optica | 04-010802 | |
| Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF20 | |
| Mouse anti Lamin A/C antibody | Novocastra | NLC-LAM-A/C | |
| 4/11/13 | Cappel | 559762 | |
| Hoechst 33342 | Sigma fluka | B2261 | |
| Rabbit anti Laminin antibody | Sigma | L9393 | |
| MATERIALS AND EQUIPMENT | |||
| Adsorbable antibacteric suture 4-0 | Ethicon | vcp310h | |
| 30G needle syringe | BD | 324826 | |
| Treadmill | Columbus instrument | ||
| Steromicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Inverted microscope | Leica | DMIL LED | |
| Isoflurane unit | Harvad Apparatus | ||
| Fiber optics | Euromecs (Holland) | EK1 | |
| Heating pad | Vet Tech | C17A1 | |
| Scalpels | Swann-Morton | 11REF050 | |
| Surgical forceps | Fine Scientific Tools | 5/45 | |
| High temperature cauteriser | Bovie Medical | AA01 | |
| MEDIA COMPOSITION | |||
| Media composition is detailed below. HIDEMs growth medium:
|
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Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media.
Riferimenti
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat. Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Minasi, M. G., et al. The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues. Development. 129, 2773-2783 (2002).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat. Commun. 2, 499 (2011).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. J. Clin. Invest. 120, 11-19 (2010).
- Sampaolesi, M., et al. Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts. Science. 301, 487-492 (2003).
- Sampaolesi, M., et al. Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature. 444, 574-579 (2006).
- Tedesco, F. S., et al. Transplantation of Genetically Corrected Human iPSC-Derived Progenitors in Mice with Limb-Girdle Muscular Dystrophy. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Tedesco, F. S., et al. Stem cell-mediated transfer of a human artificial chromosome ameliorates muscular dystrophy. Sci. Transl. Med. 3, (2011).
- Lattanzi, L., et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J. Clin. Invest. 101, 2119-2128 (1998).
- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in Duchenne muscular dystrophy cells. Hum. Gene Ther. 20, 784-790 (2009).
- Kimura, E., et al. Cell-lineage regulated myogenesis for dystrophin replacement: a novel therapeutic approach for treatment of muscular dystrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 2507-2517 (2008).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
- Wu, S. M., Hochedlinger, K. Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative medicine. Nat. Cell Biol. 13, 497-505 (2011).
