Geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide myogene voorlopers zijn veelbelovende kandidaten voor celtherapiestrategieën om spierdystrofieën te behandelen. Dit protocol beschrijft transplantatie en functionele metingen die nodig zijn om de engraftment en differentiatie van iPSC-afgeleide mesoangioblasten (een type spiergenitors) te evalueren in muismodellen van acute en chronische spierregeneratie.
Patiënt-afgeleide iPSC’s kunnen een onschatbare bron van cellen zijn voor toekomstige autologe celtherapieprotocollen. iPSC-afgeleide myogene stam-/voorlopercellen die lijken op pericyt-afgeleide mesoangioblasten (iPSC-afgeleide mesoangioblast-achtige stam/voorlopercellen: IDEM’s) kunnen worden vastgesteld op basis van iPSC’s die worden gegenereerd door patiënten die getroffen zijn door verschillende vormen van spierdystrofie. Patiëntspecifieke IDEMs kunnen genetisch worden gecorrigeerd met verschillende strategieën(bijv. lentivirale vectoren, menselijke kunstmatige chromosomen) en worden versterkt in hun myogene differentiatiepotentieel bij overexpressie van de myogeneseregulator MyoD. Dit myogene potentieel wordt vervolgens in vitro beoordeeld met specifieke differentiatietesten en geanalyseerd door immunofluorescentie. Het regeneratieve potentieel van IDEM’s wordt verder in vivogeëvalueerd , bij intramusculaire en intra-arteriële transplantatie in twee representatieve muismodellen met acute en chronische spierregeneratie. De bijdrage van IDEMs aan de gastheer skeletspier wordt vervolgens bevestigd door verschillende functionele tests bij getransplanteerde muizen. In het bijzonder wordt de verbetering van de motorische capaciteit van de dieren bestudeerd met loopbandtests. Celengraftatie en differentiatie worden vervolgens beoordeeld door een aantal histologische en immunofluorescentietesten op getransplanteerde spieren. Over het algemeen beschrijft dit artikel de assays en tools die momenteel worden gebruikt om de differentiatiecapaciteit van IDEM’s te evalueren, met de nadruk op de transplantatiemethoden en daaropvolgende uitkomstmaten om de effectiviteit van celtransplantatie te analyseren.
Mesoangioblasten (MABs) zijn met vaten geassocieerde spierfogenen afgeleid van een subset van pericyten1-3. Het belangrijkste voordeel van MABs ten opzichte van canonieke spiervoorlopers zoals satellietcellen4 ligt in hun vermogen om de vaatwand over te steken wanneer ze intra-arteriële worden geleverd en dragen dus bij aan skeletspierregeneratie in celtherapieprotocollen. Deze functie is geëvalueerd en bevestigd in zowel murine- als hondenmodellen van spierdystrofie1,5,6. Deze preklinische studies hebben de basis gelegd voor een first-in-man fase I/II klinische studie op basis van intra-arteriële transplantatie van donor HLA-identieke BLB’s bij kinderen met Duchenne spierdystrofie (EudraCT nr. 2011-000176-33; momenteel in het San Raffaele Ziekenhuis in Milaan, Italië). Een van de belangrijkste hindernissen van celtherapiebenaderingen, waarbij miljarden cellen nodig zijn om de spier van een heel lichaam te behandelen, is het beperkte proliferatieve potentieel van het “geneesmiddel” (de cellen). Bovendien is onlangs aangetoond dat het niet mogelijk is om BBB’s te verkrijgen van patiënten die getroffen zijn door sommige vormen van spierdystrofieën, omdat het voorkomt bij spierdystrofie 2D (LGMD2D; OMIM #608099)7.
Om deze beperkingen te overwinnen, is onlangs een protocol opgesteld voor het afleiden van MAB-achtige stam-/voorlopercellen uit menselijke en muriene iPSC’s7. Deze procedure genereert gemakkelijk uitbreidbare celpopulaties met een vasculaire gensignatuur en immunofenotype dat sterk lijkt op volwassen spier-afgeleide MABs. Bij expressie van de myogene regulerende factor MyoD ondergaan zowel muriene als menselijke IDEMs (respectievelijk MIDEMs en HIDEMs) terminale skeletspierdifferentiatie. Om dit doel te bereiken kunnen IDEMs worden getransduceerd met vectoren die myoD-expressie kunnen stimuleren, constitutief of op een inductieve manier8-10. Er wordt een lentivirale vector gebruikt die MyoD cDNA bevat die is gefuseerd met de oestrogeenreceptor (MyoD-ER), waardoor de nucleaire translocatie op tamoxifen (een oestrogeenanaloog) toediening11mogelijk is. Deze strategie resulteert in de vorming van hypertrofische multinucleated myotubes, met een hoog rendement7. Met name IDEM’s zijn niet-tumorigeen, kunnen bij transplantatie in gastheerspieren worden getransgrafteerd en onderscheiden en kunnen genetisch worden gecorrigeerd met behulp van verschillende vectoren(bijv. lentivirussen of menselijke kunstmatige chromosomen), waardoor de weg wordt vrijgemaakt voor toekomstige autologe therapeutische strategieën. De afleiding, karakterisering en transplantatie van IDEM’s zijn beschreven in de bovenstaande publicatie7. Dit protocoldocument beschrijft de tests die zijn uitgevoerd om de in vitro myogene differentiatie van IDEM’s te evalueren en de daaropvolgende uitkomstmetingen om de werkzaamheid van hun transplantatie in muismodellen van spierregeneratie te testen.
iPSC ‘s kunnen voor onbepaalde tijd worden uitgebreid met behoud van hun zelfvernieuwingspotentieel en dus worden gericht op differentiering in een breed scala aan cellijnen12. Om deze en andere redenen worden iPSC-afgeleide stam-/voorlopercellen beschouwd als een veelbelovende bron voor autologe gen- en celtherapiebenaderingen13. Een eerder gepubliceerd werk van de auteurs rapporteerde de generatie van muis- en menselijke myogene voorlopers van iPSC’s met een fenotype vergelijkbaar met dat van peri…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs danken Giulio Cossu, Martina Ragazzi en het hele laboratorium voor nuttige discussie en ondersteuning, en Jeff Chamberlain voor het vriendelijk leveren van MyoD-ER vector. Alle experimenten met levende dieren werden voltooid in overeenstemming met en in overeenstemming met alle relevante regelgevende en institutionele instanties, voorschriften en richtsnoeren. Het werk in het auteurslaboratorium wordt ondersteund door de Uk Medical Research Council, de 7e kaderprojecten Optistem and Biodesign van de Europese Gemeenschap en het Italiaanse Duchenne Parent Project.
REAGENTS | |||
MegaCell DMEM | Sigma | M3942 | |
DMEM | Sigma | D5671 | |
IMDM | Sigma | I3390 | |
Horse serum | Euroclone | ECS0090L | |
Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14801F | |
PBS Calcium/Magnesium free | Lonza | BE17-516F | |
L-Glutammine | Sigma | G7513 | |
Penicilline/Streptomicin | Sigma | P0781 | |
2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
ITS (Insulin-Transferrin-Selenium) | Gibco | 51500-056 | |
Non-essential amino acid solution | Sigma | M7145 | |
Fer-In-Sol | Mead Johnson | ||
Ferlixit | Aventis | ||
Oleic Acid | Sigma | 01257-10 mg | |
Linoleic Acid | Sigma | L5900-10 mg | |
Human bFGF | Gibco | AA 10-155 | |
Grow factors-reduced Matrigel | Becton Dickinson | 356230 | |
Trypsin | Sigma | T3924 | |
Sodium heparin | Mayne Pharma | ||
Trypan blue solution | Sigma | T8154 | HARMFUL |
Patent blue dye | Sigma | 19, 821-8 | |
EDTA | Sigma | E-4884 | |
Paraformaldehyde | TAAB | P001 | HARMFUL |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
4-OH Tamoxifen | Sigma | H7904 | |
pLv-CMV-MyoD-ER(T) | Addgene | 26809 | |
Cardiotoxin | Sigma | C9759 | HARMFUL |
Povidone iodine | |||
Tragachant gum | MP biomedicals | 104792 | |
Isopenthane | VWR | 24,872,323 | |
Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | |
Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
Polarized glass slides | Thermo | J1800AMNZ | |
Eosin Y | Sigma | E4382 | |
Hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
Masson's trichrome | Bio-Optica | 04-010802 | |
Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF20 | |
Mouse anti Lamin A/C antibody | Novocastra | NLC-LAM-A/C | |
4/11/13 | Cappel | 559762 | |
Hoechst 33342 | Sigma fluka | B2261 | |
Rabbit anti Laminin antibody | Sigma | L9393 | |
MATERIALS AND EQUIPMENT | |||
Adsorbable antibacteric suture 4-0 | Ethicon | vcp310h | |
30G needle syringe | BD | 324826 | |
Treadmill | Columbus instrument | ||
Steromicroscope | Nikon | SMZ800 | |
Inverted microscope | Leica | DMIL LED | |
Isoflurane unit | Harvad Apparatus | ||
Fiber optics | Euromecs (Holland) | EK1 | |
Heating pad | Vet Tech | C17A1 | |
Scalpels | Swann-Morton | 11REF050 | |
Surgical forceps | Fine Scientific Tools | 5/45 | |
High temperature cauteriser | Bovie Medical | AA01 | |
MEDIA COMPOSITION | |||
Media composition is detailed below. HIDEMs growth medium:
|
|||
Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media.