Modification multi-échelle des implants métalliques avec des gradients des pores, polyélectrolytes et leur surveillance indirecte<em> In vivo</em
Summary
Dans cette vidéo, nous allons démontrer les techniques de modification pour les implants métalliques poreux pour améliorer leur fonctionnalité et de contrôler la migration cellulaire. Les techniques comprennent le développement de gradients de pores pour commander le déplacement de la cellule en 3D et de la production de la membrane basale imite pour commander le mouvement de cellule à deux dimensions. En outre, une méthode HPLC pour la surveillance en intégration de l'implant in vivo via l'analyse des protéines du sang est décrit.
Abstract
Implants métalliques, notamment des implants en titane, sont largement utilisés dans des applications cliniques. La croissance tissulaire et l'intégration de ces implants dans les tissus sont des paramètres importants pour les résultats cliniques réussies. Afin d'améliorer l'intégration des tissus, des implants métalliques poreux sont en cours d'élaboration. La porosité ouverte de mousses métalliques est très avantageux, étant donné que les zones interstitielles peuvent être fonctionnalisés, sans compromettre les propriétés mécaniques de la structure entière. Nous décrivons ici les modifications à l'aide d'implants en titane poreux à base de microbilles de titane. En utilisant les propriétés physiques inhérentes telles que l'hydrophobie de titane, il est possible d'obtenir des gradients de pores hydrophobes à l'intérieur des implants métalliques à base de microbilles et en même temps, d'avoir une membrane basale imitateur, basée sur des polymères naturels hydrophiles. Gradients de pores 3D sont constitués par des polymères synthétiques tels que l'acide poly-L-lactique (PLLA) par la méthode de congélation-extraction. 2D nanofibrillar surles faces sont formées à l'aide de collagène / alginate suivie d'une étape de réticulation avec un agent de réticulation naturel (génipine). Ce film nanofibrillar a été construite par couche par couche (LBL) du procédé de dépôt des deux molécules de charge opposée, le collagène et l'alginate. Enfin, un implant où les différentes zones peuvent accueillir différents types de cellules, comme cela est nécessaire pour de nombreux tissus multicellulaires, peut être obtenue. Par ce moyen mouvement cellulaire dans des directions différentes en différents types de cellules peut être contrôlée. Un tel système est décrit dans le cas spécifique de la trachée régénération, mais il peut être modifié pour d'autres organes cibles. L'analyse de la migration cellulaire et les méthodes possibles pour créer différents gradients de pores sont élaborés. La prochaine étape dans l'analyse de ces implants est leur caractérisation après l'implantation. Cependant, l'analyse histologique des implants métalliques est un processus long et fastidieux, donc pour le suivi réaction de l'hôte à des implants métalliques in vivo une unelternative méthode basée sur le suivi de protéines sanguines CGA et différent est également décrite. Ces méthodes peuvent être utilisées pour le développement de la migration sur mesure vitro et des essais de colonisation dans et également être utilisés pour l'analyse des implants métalliques fonctionnalisés in vivo sans histologie.
Introduction
Actuellement implants métalliques disponibles conviennent aux applications porteurs, mais leur non-dégradabilité nécessitent conceptions qui garantissent une interface forte avec le tissu qui les entoure 1. En prévoyant des structures qui facilitent la croissance cellulaire et la colonisation in vivo, la durée de vie des implants métalliques peut être prolongée 2. Implants métalliques ouvertement poreux sont des matériaux pour l'ingénierie de l'interface tissu prometteurs et aussi pour assurer une bonne colonisation des implants. Ils ont été utilisés activement que les implants orthopédiques et implants aussi trachéales 3-5. Cependant, il ya encore des problèmes qui doivent être résolus tels que le contrôle précis sur le mouvement des cellules dans les zones interstitielles. L'incapacité à contrôler ce processus pourrait conduire à la colonisation incomplète dans une extrémité et de la resténose dans l'autre. Aussi fonctionnalisation supplémentaire de ces implants est nécessaire pour la réalisation de fonctions plus élevées telles que, la livraison de facteurs de croissance,vascularisation dirigé et un mouvement simultané de différents types de cellules 8.6. Pour les implants trachée, ce qui est crucial que la colonisation de l'implant par un tissu vascularisé est souhaitable. Cependant, le tissu incontrôlée en croissance à la lumière de la trachée n'est pas souhaitable, car elle diminue la perméabilité de l'implant.
Une possibilité de contrôler le mouvement des cellules est de taille exclusion. En connaissant la taille des cellules cibles et leur capacité à interagir avec un polymère synthétique étant donné qu'il est possible d'élaborer des gradients de pores qui peut effectivement de déterminer la profondeur de circulation des cellules. Par exemple en créant une architecture pore qui est assez grand pour l'entrée des cellules du tissu conjonctif telles que les fibroblastes extraluminale, mais assez petites (moins de 10 um) pour empêcher leur mouvement intraluminale un contrôle effectif sur la colonisation d'un implant tubulaire peut être réalisé.
De méthodes de création de pores disponibles tels que gel drying, le lessivage des particules, gaz de moussage 9,10; le plus facile à adapter la méthode pour la formation rapide de gradients pores avec minimum d'équipements nécessaires est de gel-extraction 11. Dans ce procédé, une solution de polymère est congelée dans un mélange binaire d'un solvant organique et de l'eau. Ensuite, le solvant est échangé par l'intermédiaire de l'extraction par un liquide pré-refroidi miscible tel que l'éthanol. Congélation et des conditions d'extraction déterminent la forme et la taille des pores, et si l'extraction est réalisée d'une manière où le mouvement de la solution d'extraction peut être commandé, la taille des pores et la forme peuvent être directionnellement modulé.
Deuxième étape de tissus multicellulaires est la formation de barrières poreuses entre les différents types de cellules pour contrôler leur interaction. Cela est également nécessaire pour la disponibilité des différents micro-environnements pour les différents types de cellules en fonction de leurs exigences 12,13. Trachée est un organe tubulaire qui relie le larynx avec bronchi. Il a une pseudostratifié doublure de l'épithélium ciliaire intérieur des cellules à mucus interdispersées qui produisent du mucus. La structure 3D et la stabilité de la trachée est maintenue par le cartilage en forme de C-rings. Ainsi, dans une trachée artificielle il devrait y avoir une jonction définie entre le tissu conjonctif et la couche épithéliale ciliaire. Bien que d'une structure 3D est nécessaire pour la partie de tissu conjonctif, la migration des cellules épithéliales nécessite une membrane en forme de sous-sol surface pour réaliser le mouvement directionnel et la fermeture de la plaie. Polyélectrolytiques films multicouches (PEM) sont une option possible pour obtenir des imitateurs de la membrane basale. Procédé par couche de la couche (LBL) est un procédé polyvalent pour obtenir des revêtements de surface mince et fonctionnel. Il est basé sur des interactions électrostatiques de deux polyélectrolytes de charges opposées et leur accumulation dans une manière séquentielle pour obtenir des revêtements de surface nanométrique dont les propriétés peuvent être modifiées en changeant simplement les variables telles que les espèces de polyélectrolytes, le pH,numéro de couche, l'ajout d'une couche de recouvrement, etc réticulation Un des principaux avantages de la méthode LbL est sa capacité à se conformer à la topographie du substrat sous-jacent. Ainsi, dans des conditions contrôlées, cette méthode peut aussi être utilisée pour obtenir une couverture de surface de structures poreuses. Si le collagène est utilisé comme l'un des polyélectrolytes, il est possible d'obtenir des structures nanofibrillar qui peuvent imiter la surface de la membrane basale. L'hydrophobie de titane permet le développement de ces structures et fibrillarity peut être préservée dans les revêtements épais 14. De cette façon, l'attachement et le mouvement de cellule à la surface peut également être contrôlée. En utilisant de gel-extraction et de revêtement de film par couche de manière séquentielle, une structure dans laquelle le mouvement des cellules peut être commandée latéralement, longitudinalement et circonférentiellement peut être obtenue 15.
Ici, nous décrivons deux méthodes de modification nouvelles pour les implants en titane à l'aide de leur comportement hydrophobe qui peut êtreétendu à la modification des divers implants poreux: i) la formation de gradients de micropores à l'intérieur des implants en titane macroporeux avec hydrophobes, des polymères synthétiques, ii) la formation d'une couche de film polymère épais sur la surface de l'implant qui favorise la croissance cellulaire et la formation de la garniture par des multicouches de polyélectrolytes. Ces méthodes peuvent être utilisées successivement ou séparément. Ils fournissent des structures qui assurent la migration contrôlée et l'organisation spatiale des différents types de cellules dans les tissus multicellulaires 16,17. Pour le cas spécifique de la trachée, le résultat souhaité pour l'implant serait la colonisation par le tissu fibro-vasculaire dans les gradients micropores sans resténose et la formation de la paroi interne des cellules épithéliales ciliées sur les multicouches de polyélectrolytes.
Une façon de contrôler l'intégration des implants est de faire de petites interventions chirurgicales au cours de la période de leur intégration avec l'hôte in situ. Afin d'être en mesure to décider du calendrier des interventions, il est important d'avoir des informations sur les effets systémiques de l'implant. C-Reactive Protein (CRP) a été utilisé pour la surveillance de l'infection et la réponse inflammatoire dans les milieux cliniques. Chromogranine A (CGA) peut également être utilisé de manière similaire et pourrait fournir des résultats plus précis pour observer le niveau d'inflammation 18. Comme un moyen possible d'observer l'intégration de l'implant métallique in vivo, nous présentons une procédure de surveillance continue des effets systémiques de l'implant par la caractérisation d'échantillons sanguins animaux avec la chromatographie liquide à haute pression (HPLC) et le séquençage des protéines ultérieure. Élaboration de cette méthode peut être utilisée pour échapper à l'analyse histologique point final régulière. Coupe histologique des implants métalliques est un processus long, lourd et coûteux et peut être effectuée uniquement à des moments spécifiques. Pour cette raison, les tests sanguins qui fournissent des informations solides sur la santé de l'implant bien conçuêtre les voies possibles pour réduire l'expérimentation animale tel que mandaté par les récentes règles de l'UE concernant l'expérimentation animale.
Les méthodes présentées ici peuvent être utilisés pour améliorer la performance des implants métalliques par fonctionnalisation ou d'avoir une autre façon de contrôler les implants existants.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gradients pores sont des outils importants dans l'ingénierie tissulaire de l'interface et le système décrit ici peut être utilisé seul ou en combinaison avec des implants métalliques pour former des pores gradient d'étudier la migration cellulaire. Le système ne nécessite aucun réglage supplémentaire ou matériel supplémentaire, sauf une hotte à manipuler des solvants organiques, donc elle peut être appliquée dans les laboratoires de biologie. Polymères similaires tels que le poly (acide glyc…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le Dr André Walder et Nicolas Perrin pour les implants en titane fabrication, K. Benmlih pour l'accumulation des moules en téflon et le Dr G. Prévost pour son aide à l'expérimentation animale. Nous reconnaissons également la Région Alsace et PMNA (Pôle Matériaux et Nanosciences d'Alsace) pour sa contribution financière.
Materials
| Reagent | |||
| Dioxane | Sigma-Aldrich | 360481 | Toxic material, Strictly under chemical hood |
| PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g |
Sigma-Aldrich | 94829, 81273 | The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent. |
| PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate) | Novamatrix | 4200006 | Low viscosity(20-200 mPa.s) |
| Collagen type I (Bovine) | Symatese | CBPE2US100 | |
| Pen/Strep, Fungizone | Promocell | C42020 | |
| Genipin | Wako | 0703021 | |
| Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1. | Bruker | MSCT | |
| Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0% | Sigma-Aldrich | 302031 | Hazardous Material, Please follow MSDS carefully |
| Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9% | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | C3100MP | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit | Genway Bio | GWB-9BF960 | |
| DMSO, Bioreagent, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Equipment | |||
| Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope | Bruker | ||
| Procise microsequencer | Applied Biosystems | ||
| Ultima 3000 HPLC system | Dionex | ||
| Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100 | Hitachi | ||
| Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510 | Zeiss |
Table 1. List of Materials and Reagents.
Riferimenti
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