Multi-Scale modificatie van metalen implantaten Met Pore Verlopen, polyelektrolieten en hun indirecte monitoring<em> In vivo</em
Summary
In deze video laten we zien modificatie technieken voor poreuze metalen implantaten om hun functionaliteit te verbeteren en om celmigratie te controleren. Technieken omvatten de ontwikkeling van poriën verlopen naar cel beweging beheersen 3D en productie van basale membraan bootst naar cel beweging beheersen 2-D. Ook is een HPLC-methode voor toezicht integratie implantaten in vivo via analyse bloedeiwitten beschreven.
Abstract
Metalen implantaten, vooral titanium implantaten worden veel gebruikt in klinische toepassingen. Ingroei van weefsel en integratie deze implantaten in de weefsels zijn belangrijke parameters voor succesvolle klinische resultaten. Om weefselintegratie te verbeteren, hebben poreuze metalen implantaten ontwikkeld. Open porositeit van metallisch schuim is zeer voordelig, omdat de porie gebieden kunnen worden gefunctionaliseerd zonder de mechanische eigenschappen van de gehele structuur. Hier beschrijven we dergelijke wijzigingen met poreus titanium implantaten op basis van titanium microbolletjes. Door inherente fysische eigenschappen zoals hydrofobiciteit van titanium, is het mogelijk om hydrofobe poriën gradiënten vinden binnen microbead gebaseerde metalen implantaten en tegelijkertijd om een fundament membraan bootsen basis van hydrofiele, natuurlijke polymeren. 3D porie verlopen worden gevormd door synthetische polymeren zoals poly-L-melkzuur (PLLA) door vries-extractiemethode. 2D nanofibrillar survlakken worden gevormd door collageen / alginaat gevolgd door een verknopende stap met een natuurlijke crosslinker (genipin). Deze nanofibrillar film werd per laag opgebouwd door laag (LBL) depositie methode van de twee tegengesteld geladen moleculen, collageen en alginaat. Tenslotte, een implantaat waarbij verschillende gebieden geschikt verschillende celtypes, zulks voor vele meercellige weefsels, kan worden verkregen. Door deze wijze cellulaire beweging in verschillende richtingen door verschillende celtypen kan worden geregeld. Een dergelijk systeem wordt beschreven voor het specifieke geval van trachea regeneratie, maar kan worden aangepast voor andere doelorganen. Analyse van de cel migratie en de mogelijke methoden voor het creëren van verschillende porie-gradiënten worden uitgewerkt. De volgende stap in de analyse van dergelijke implantaten is hun karakterisering na implantatie. Echter, histologische analyse van metalen implantaten is een lang en moeizaam proces, dus voor het toezicht gastheerreactie metallische implantaten in vivo een alternatieve methode gebaseerd op monitoring CGA en verschillende bloed-eiwitten wordt ook beschreven. Deze werkwijzen kunnen worden gebruikt voor het ontwikkelen in vitro maat migratie en kolonisatie tests en worden gebruikt voor analyse van gefunctionaliseerde metalen implantaten in vivo zonder histologie.
Introduction
Momenteel beschikbare metalen implantaten zijn geschikt voor dragende toepassingen, maar zij niet-afbreekbaar noodzakelijk ontwerpen die een sterke koppeling met het omringende weefsel te waarborgen 1. Door structuren die cellulaire ingroei en kolonisatie in vivo te vergemakkelijken, kan de levensduur van metalen implantaten worden verlengd 2. Openlijk poreuze metalen implantaten zijn veelbelovende materialen voor tissue-interface engineering en ook voor het waarborgen van een goede kolonisatie van de implantaten. Zij zijn actief als orthopedische implantaten en als tracheale implantaten 3-5. Er zijn echter nog problemen die moeten worden opgelost, zoals de nauwkeurige controle over de beweging van cellen in de porie gebieden. Niet dit proces te controleren kan leiden tot onvolledige kolonisatie in een uiteinde en restenose in de andere. Ook verdere functionalisering van deze implantaten is noodzakelijk voor het bereiken van hogere functies, zoals afgifte van groeifactoren,geregisseerd vascularisatie en gelijktijdige beweging van verschillende celtypes 6-8. Tracheale implantaten, is belangrijk als de kolonisatie van het implantaat door een gevasculariseerd weefsel gewenst is. De ongecontroleerde weefsel-groei het lumen van trachea is ongewenst omdat het verlaagt implantaat patency.
Een mogelijkheid tot cel beweging te controleren is uitsluiting op grootte. Door het kennen van de omvang van de doelcellen en hun vermogen tot interactie met een bepaald synthetisch polymeer is het mogelijk om gradiënten van poriën effectief bepalen de diepte van celbeweging ontwikkelen. Bijvoorbeeld door een porie architectuur die groot genoeg is voor de toevoeging van bindweefselcellen zoals fibroblasten extraluminally, maar klein genoeg (minder dan 10 um) om hun beweging intraluminaal voorkomen dat een effectieve controle kolonisatie van een buisvormig implantaat kan worden bereikt.
Uit beschikbare porie creatie methoden zoals freeze-drying, deeltje uitloging, gas schuimende 9,10, het makkelijkst te passen methode voor snelle vorming van poriën gradiënten met een minimale hoeveelheid benodigde apparatuur is freeze-extractie 11. In deze werkwijze wordt een polymeeroplossing bevroren in een binair mengsel van een organisch oplosmiddel en water. Daarna wordt het oplosmiddel uitgewisseld via extractie met een mengbaar voorgekoelde vloeistof zoals ethanol. Invriezen en extractiecondities bepalen de vorm en grootte van de poriën en wanneer de extractie op een manier waarbij de beweging van de extractieoplossing kan worden geregeld, kan poriegrootte en vorm hebben gerichte gemoduleerd.
Tweede stap meercellige weefsels is de vorming van poreuze grenzen tussen verschillende celtypen op hun wisselwerking te controleren. Dit is ook nodig voor de beschikbaarheid van verschillende micro-omgevingen voor verschillende celtypes afhankelijk van hun behoeften 12,13. Luchtpijp is een buisvormig orgaan dat strottenhoofd verbindt met bronchi. Het heeft een innerlijke pseudostratified ciliaire epitheel voering met onderling gedispergeerd slijmbekercellen die slijm produceren. De 3D-structuur en stabiliteit van de trachea gehouden door kraakbeen in de vorm van C-ringen. Dus in een kunstmatige trachea moet er een bepaalde verbinding tussen het bindweefsel en het ciliaire epitheel laag. Terwijl een 3D structuur voor de bindweefselgedeelte, de migratie van epitheelcellen vereist een basaal membraan-achtige oppervlak gerichte beweging en wondsluiting bereiken. Polyelectrolyt meerlaagse folies (PEM) een mogelijkheid zijn om basale membraan mimiek te verkrijgen. Layer-by-layer methode (LBL) is een veelzijdige werkwijze te dun en functionele coatings te verkrijgen. Het is gebaseerd op elektrostatische interacties van twee tegengesteld geladen polyelektrolyten en hun opbouw in een sequentiële wijze nanoschaal coatings waarvan de eigenschappen kunnen worden gevarieerd door simpelweg variabelen zoals polyelektrolyt species, pH verkrijgen,laagnummer, toevoeging van een deklaag, verknoping etc. Een van de belangrijkste voordelen van de LbL werkwijze is de mogelijkheid om te voldoen aan de topografie van het onderliggende substraat. Aldus, onder gecontroleerde omstandigheden kan deze methode ook worden gebruikt voor het oppervlaktebedekking van poreuze structuren. Wanneer collageen wordt gebruikt als een van de polyelektrolyten kan men nanofibrillar structuren die het oppervlak van fundament membraan kan nabootsen verkrijgen. De hydrofobe eigenschappen van titanium maakt de ontwikkeling van dergelijke structuren en fibrillarity kan worden bewaard in dikke coatings 14. Zo hechting en beweging van cellen op het oppervlak kan ook worden geregeld. Door freeze-extractie en LbL filmbekleding achtereenvolgens, een structuur waarin celbeweging zijdelings worden gecontroleerd langsrichting en omtreksrichting worden verkregen 15.
Hier beschrijven we twee nieuwe modificatiewerkwijzen voor titanium implantaten door hun hydrofobe gedrag dat kan wordenuitgebreid tot een wijziging van verschillende poreuze implantaten: i) vorming van gradiënten van microporiën in de macroporeuze titanium implantaten met hydrofobe, synthetische polymeren ii) vorming van een dikke polymere filmlaag op het oppervlak van het implantaat die celgroei en voering vorming van polyelektrolyt multilagen ondersteunt. Deze werkwijzen kunnen sequentieel of afzonderlijk worden gebruikt. Ze bieden structuren die gecontroleerde migratie en ruimtelijke organisatie van verschillende celtypes in meercellige weefsels 16,17 garanderen. Voor het specifieke geval van de trachea, zou het gewenste resultaat voor het implantaat de kolonisatie fibrovasculair weefsel binnen de microporiën verlopen zonder restenose en de vorming van de binnenwand van gecilieerde epitheliale cellen op de polyelektrolyt multilagen.
Een manier van het controleren integratie van implantaten is een kleine chirurgische ingrepen tijdens de duur van hun integratie in de gastheer in situ. Om te kunnen to beslissen over de timing van zijn optreden, is het belangrijk om informatie over de systemische effecten van de implantaat. C-reactief proteïne (CRP) is gebruikt voor bewaking van infecties en inflammatoire respons in klinische settings. Chromogranine A (CGA) kan ook worden gebruikt op een soortgelijke wijze kunnen nauwkeurigere resultaten aan de graad van inflammatie 18 waarnemen. Als een mogelijke manier van observeren metallic integratie implantaat in vivo, presenteren we een voortdurende controle procedure van implantaat systemische effecten door karakterisering van dierlijke bloedmonsters met High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) en de daaropvolgende eiwit sequencing. Uitwerking van deze methode kan worden gebruikt om ontwijken regelmatige eindpunt histologische analyse. Histologische snijden van metalen implantaten is een lang, omslachtig en duur proces en kan alleen plaatsvinden op specifieke tijdstippen. Omwille van deze reden, goed ontworpen bloedtesten leveren van robuuste informatie over de gezondheid implantaat zouzijn mogelijke routes om dierproeven te verminderen als mandataris van de recente EU-regels inzake dierproeven.
De hier gepresenteerde werkwijzen kunnen worden gebruikt om de prestaties van metalen implantaten via functionalisering verbeteren of om een alternatieve manier van controle bestaande implantaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Porie gradiënten zijn belangrijke hulpmiddelen in de interface tissue engineering en het hier beschreven systeem kan alleen of in combinatie met metalen implantaten worden gebruikt om porie gradiënt te vormen tot cel migratie te bestuderen. Het systeem heeft geen extra instelling of extra apparatuur, behalve een zuurkast aan organische oplosmiddelen hanteren niet noodzakelijk, waardoor het kan worden toegepast in biologische laboratoria. Vergelijkbare polymeren zoals poly (glycolzuur) (PGA), poly (melkzuur-co-glycolzu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Auteurs willen graag Dr Andre Walder en Nicolas Perrin voor het vervaardigen van titanium implantaten, K. Benmlih bedanken voor de opbouw van de Teflon matrijzen en dr. G. Prevost voor zijn hulp bij dierproeven. Wij erkennen ook de regio Elzas en PMNA (Pole Materiaux et nanowetenschappen d'Alsace) voor de financiële bijdrage.
Materials
| Reagent | |||
| Dioxane | Sigma-Aldrich | 360481 | Toxic material, Strictly under chemical hood |
| PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g |
Sigma-Aldrich | 94829, 81273 | The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent. |
| PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate) | Novamatrix | 4200006 | Low viscosity(20-200 mPa.s) |
| Collagen type I (Bovine) | Symatese | CBPE2US100 | |
| Pen/Strep, Fungizone | Promocell | C42020 | |
| Genipin | Wako | 0703021 | |
| Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1. | Bruker | MSCT | |
| Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0% | Sigma-Aldrich | 302031 | Hazardous Material, Please follow MSDS carefully |
| Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9% | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | C3100MP | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit | Genway Bio | GWB-9BF960 | |
| DMSO, Bioreagent, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Equipment | |||
| Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope | Bruker | ||
| Procise microsequencer | Applied Biosystems | ||
| Ultima 3000 HPLC system | Dionex | ||
| Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100 | Hitachi | ||
| Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510 | Zeiss |
Table 1. List of Materials and Reagents.
Riferimenti
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat. Mater. 4, 518-524 (2005).
- Ryan, G., Pandit, A., Apatsidis, D. P. Fabrication methods of porous metals for use in orthopaedic applications. Biomaterials. 27, 2651-2670 (2006).
- Schultz, P., Vautier, D., Charpiot, A., Lavalle, P., Debry, C. Development of tracheal prostheses made of porous titanium: a study on sheep. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 264, 433-438 (2007).
- Janssen, L. M., et al. Laryngotracheal reconstruction with porous titanium in rabbits: are vascular carriers and mucosal grafts really necessary. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 4, 395-403 (2010).
- Li, J. P., et al. Bone ingrowth in porous titanium implants produced by 3D fiber deposition. Biomaterials. 28, 2810-2820 (2007).
- Schultz, P., et al. Polyelectrolyte multilayers functionalized by a synthetic analogue of an anti-inflammatory peptide, alpha-MSH, for coating a tracheal prosthesis. Biomaterials. 26, 2621-2630 (2005).
- Müller, S., et al. VEGF-Functionalized Polyelectrolyte Multilayers as Proangiogenic Prosthetic Coatings. Advanced Functional Materials. 18, 1767-1775 (2008).
- Mills, R. J., Frith, J. E., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J. Effect of Geometric Challenges on Cell Migration. Tissue Engineering Part C-Methods. 17, 999-1010 (2011).
- O’Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 26, 433-441 (2005).
- Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26, 5474-5491 (2005).
- Budyanto, L., Goh, Y. Q., Ooi, C. P. Fabrication of porous poly(L-lactide) (PLLA) scaffolds for tissue engineering using liquid – liquid phase separation and freeze extraction. J. Mater. Sci. Mater. Med. 20, 105-111 (2009).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
- Chaubaroux, C., et al. Collagen-Based Fibrillar Multilayer Films Cross-Linked by a Natural Agent. Biomacromolecules. 13, 2128-2135 (2012).
- Huang, Y., Siewe, M., Madihally, S. V. Effect of spatial architecture on cellular colonization. Biotechnology and Bioengineering. 93, 64-75 (2006).
- Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Unger, R. E. Co-culture systems for vascularization – Learning from nature. Advanced Drug Delivery Reviews. 63, 291-299 (2011).
- Lavalle, P., et al. Dynamic Aspects of Films Prepared by a Sequential Deposition of Species: Perspectives for Smart and Responsive Materials. Advanced Materials. 23, 1191-1221 (2011).
- Zhang, D., et al. Serum concentration of chromogranin A at admission: An early biomarker of severity in critically ill patients. Annals of Medicine. 41, 38-44 (2009).
- Goh, Y., Ooi, C. Fabrication and characterization of porous poly(l -lactide) scaffolds using solid – liquid phase separation. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, 2445-2452 (2008).
- Vrana, N. E., et al. Modification of macroporous titanium tracheal implants with biodegradable structures: Tracking in vivo integration for determination of optimal in situ epithelialization conditions. Biotechnology and Bioengineering. 109, 2134-2146 (2012).
- Dupret-Bories, A., et al. Development of surgical protocol for implantation of tracheal prostheses in sheep. J. Rehabil. Res. Dev. 48, 851-864 (2011).
- Gasnier, C. Characterization and location of post-translational modifications on chromogranin B from bovine adrenal medullary chromaffin granules. Proteomics. 4, 1789-1801 (2004).
- Vrana, N. E. Hybrid Titanium/Biodegradable Polymer Implants with an Hierarchical Pore Structure as a Means to Control Selective Cell Movement. PLoS ONE. 6, e20480 (2011).
- Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. W. Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (66), e4032 (2012).
- Dong, C. -. M., et al. Photomediated crosslinking of C6-cinnamate derivatized type I collagen. Biomaterials. 26, 4041-4049 (2005).
