Multi-Skala Modifikation von metallischen Implantaten mit Pore Farbverläufe, Polyelektrolyte und ihre indirekte Überwachung<em> In vivo</em
Summary
In diesem Video zeigen wir Ihnen, Modifikation Techniken für poröse metallische Implantate, um ihre Funktionalität zu verbessern und die Zellwanderung steuern. Techniken umfassen die Entwicklung von Poren Gradienten zu Zelle Bewegung in 3D und Produktion von Basalmembran imitiert zu Zelle Bewegung in 2-D zu steuern. Auch ist eine HPLC-Methode zur Überwachung Implantatintegration in-vivo durch eine Analyse von Blut Proteine beschrieben.
Abstract
Metallic Implantaten, insbesondere Titan-Implantate, sind weit verbreitet in klinischen Anwendungen eingesetzt. Tissue in-Wachstum und Integration dieser Implantate im Gewebe sind wichtige Parameter für eine erfolgreiche klinische Ergebnisse. Um Gewebe Integration zu verbessern, haben poröse metallische Implantate entwickelt. Offene Porosität von metallischen Schäumen ist sehr vorteilhaft, da die Poren Bereiche, ohne die mechanischen Eigenschaften der ganzen Struktur funktionalisiert werden können. Hier beschreiben wir solche Modifikationen mit porösem Titan-Implantate auf Titan Mikrokügelchen basiert. Durch die Verwendung von inhärenten physikalischen Eigenschaften wie Hydrophobie von Titan, ist es möglich, hydrophoben Poren Gradienten innerhalb Mikrokügelchen auf metallischen Implantaten und zur gleichen Zeit zu erhalten, müssen eine Basalmembran an hydrophilen, natürlichen Polymeren imitieren basiert. 3D Poren Gradienten werden durch synthetische Polymere, wie Poly-L-Milchsäure (PLLA) durch Gefriertrocknen Extraktionsverfahren gebildet wird. 2D Nanofibrill surFlächen mit Kollagen / Alginat durch einen Vernetzungsschritt mit einem natürlichen Vernetzer (genipin) gefolgt ist. Diese Nanofasern Folie wurde um Schicht (LbL)-Abscheidungsverfahren der beiden entgegengesetzt geladenen Molekülen, Kollagen und Alginat aufgebaut. Schließlich ein Implantat, wo verschiedene Bereiche verschiedene Zelltypen aufnehmen kann, als dies erforderlich ist für viele vielzelligen Geweben, erhalten werden. Durch kann auf diese Weise zelluläre Bewegung in verschiedenen Richtungen von unterschiedlichen Zelltypen gesteuert werden. Ein solches System ist für den speziellen Fall der Luftröhre Regeneration beschrieben, aber es kann auch für andere Zielorgane modifiziert werden. Analyse der Zellwanderung und die möglichen Methoden für die Erstellung von verschiedenen Pore Gradienten werden erarbeitet. Der nächste Schritt in der Analyse solcher Implantate ist die Charakterisierung nach der Implantation. Allerdings ist die histologische Analyse von metallischen Implantaten ein langer und mühsamer Prozess, also für Überwachungs-Host Reaktion auf metallische Implantate in vivo eine einerlternative Verfahren zur Überwachung und CGA verschiedenen Blut-Proteinen wird ebenfalls beschrieben. Diese Methoden können für die Entwicklung von in vitro maßgeschneiderte Migration und Kolonisation Tests verwendet werden und auch für die Analyse von funktionalisierten metallischen Implantaten in vivo ohne Histologie verwendet werden.
Introduction
Derzeit verfügbare metallische Implantate eignen sich für tragende Anwendungen, aber ihre nicht Abbaubarkeit erforderlich Designs, die eine starke Grenzfläche mit dem Gewebe um sie 1 sicherzustellen. Durch die Bereitstellung von Strukturen, die in zelluläre Wachstum und Kolonisierung in vivo zu erleichtern, kann die Lebensdauer der metallischen Implantaten 2 verlängert werden. Offen poröse metallische Implantate sind vielversprechende Materialien für Tissue Engineering und Schnittstelle auch für eine gute Besiedlung der Implantate. Sie wurden aktiv als orthopädische Implantate und auch als Luftröhre Implantate 3-5 verwendet. Jedoch gibt es immer noch Probleme, die wie die genaue Kontrolle über die Bewegung der Zellen in den Poren Bereiche gelöst werden müssen. Die Nichtbeachtung dieser Prozess steuern könnte zu einer unvollständigen Kolonisation in einem Ende und Restenose in der anderen führen. Auch weitere Funktionalisierung dieser Implantate ist notwendig für die Erreichung höherer Funktionen, wie die Lieferung von Wachstumsfaktoren,gerichtet Vaskularisierung und gleichzeitige Bewegung der verschiedenen Zelltypen 6-8. Für trachealen Implantate ist dies wichtig, da die Besiedlung des Implantats durch einen vaskularisierten Gewebe erwünscht ist. Jedoch ist das unkontrollierte Wachstum eines Gewebes, um das Lumen der Luftröhre unerwünscht, da sie Implantat Durchgängigkeit abnimmt.
Eine Möglichkeit zur Bewegung der Zellen steuern Größe Ausgrenzung. Durch die Kenntnis der Größe der Zielzellen und ihre Fähigkeit, mit einem bestimmten synthetischen Polymer wechselwirken kann man Gradienten von Poren, die effektiv bestimmen die Tiefe der Zelle Bewegung zu entwickeln. Zum Beispiel, indem ein Porenarchitektur, die groß genug für die Eingabe von Bindegewebszellen, wie Fibroblasten extraluminally, aber klein genug ist (weniger als 10 um), um ihre Bewegung zu verhindern intraluminally eine wirksame Kontrolle über Besiedlung einer röhrenförmigen Implantats erreicht wird.
Von Verfügung Porenerzeugung Methoden wie Gefrier-Trockenmaschng, Partikel Auslaugung, Gas Schäumen 9,10; die einfachste Methode für die schnelle Bildung von Poren Gradienten anzupassen mit minimalen notwendigen Ausrüstungen ist Gefrier-Extraktion 11. In diesem Verfahren wird ein Polymer-Lösung in einer binären Mischung eines organischen Lösungsmittels und Wasser eingefroren. Anschließend wird das Lösungsmittel durch Extraktion mit einem mischbaren vorgekühlten Flüssigkeit, wie Ethanol ausgetauscht. Einfrieren und Extraktion bestimmen die Form und Größe der Poren und wenn die Extraktion in einer Weise, wo die Bewegung der Extraktionslösung gesteuert werden kann erfolgt, Porengröße und Form kann direktional moduliert.
Zweiter Schritt für mehrzellige Gewebe ist die Bildung von porösen Schranken zwischen verschiedenen Zelltypen, um ihre Wechselwirkung zu steuern. Dies ist auch notwendig für die Verfügbarkeit der verschiedenen Mikroumgebungen für verschiedene Zelltypen je nach Bedarf 12,13. Trachea ein röhrenförmiges Organ, Kehlkopf verbindet mit Bronchi. Es verfügt über einen inneren pseudostratified Ciliarepithel Futter mit interdispergierte Becherzellen, die Schleim produzieren. Die 3D-Struktur und Stabilität der Luftröhre von Knorpel in der Form von C-Ring gehalten wird. Somit wird in einer künstlichen Luftröhre sollte eine definierte Verbindung zwischen dem Bindegewebe und dem ciliary Epithelschicht sein. Während eine 3D-Struktur ist für den Bindegewebeteil notwendig, erfordert die Migration von Epithelzellen aus Basalmembran-ähnlichen Oberfläche gerichtete Bewegung und Verschließen der Wunde zu erreichen. Polyelektrolytmultischicht Filme (PEM) sind eine mögliche Option, um Basalmembran Mimik erhalten. Schicht-für-Schicht-Verfahren (LBL) ist ein vielseitiges Verfahren zu dünn und der Beschichtung von Oberflächen zu erhalten. Es ist auf elektrostatischen Wechselwirkungen von zwei entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten und deren Aufbau in einer sequentiellen Weise basierend auf nanoskaligen Oberflächenbeschichtungen, deren Eigenschaften durch einfaches Ändern Variablen wie Polyelektrolytspezies, pH variiert werden erhalten,Schicht Nummer Zugabe einer Deckschicht, Vernetzung usw. Einer der wichtigsten Vorteile der LbL-Methode ist die Möglichkeit, an die Topographie des darunterliegenden Substrats entsprechen. Somit wird unter kontrollierten Bedingungen kann dieses Verfahren auch zur Gewinnung von Oberflächenbedeckung von porösen Strukturen verwendet werden. Wenn Kollagen als einer der Polyelektrolyte ist es möglich, Nanofibrill Strukturen, die die Oberfläche der Basalmembran erhalten nachahmen kann. Die Hydrophobie von Titan ermöglicht die Entwicklung solcher Strukturen und fibrillarity können in dicken Schichten 14 beibehalten werden. Auf diese Weise Befestigung und Bewegung der Zelle auf der Oberfläche gesteuert werden. Durch die Verwendung von Gefrier-Extraktion und LbL Filmbeschichtung sequentiell kann eine Struktur, bei der Zellbewegung seitlich gesteuert werden kann, in Längsrichtung und in Umfangsrichtung 15 erhalten werden.
Hier beschreiben wir zwei neue Methoden zur Modifikation Titan-Implantate mit ihrer hydrophoben Verhalten, das kannerweitert Modifikation verschiedene poröse Implantate: i) Bildung von Gradienten von Mikroporen in den makroporösen Titan-Implantate mit hydrophoben, synthetischen Polymeren, ii) Bildung einer dicken polymeren Filmschicht auf der Implantatoberfläche, die Zellwachstum und Futter Bildung von Polyelektrolyt unterstützt. Diese Verfahren können sequentiell oder separat verwendet werden. Sie bieten Strukturen, die kontrollierte Migration und räumliche Organisation der verschiedenen Zelltypen in vielzelligen Geweben 16,17 gewährleisten. Für den speziellen Fall der Luftröhre, würde das gewünschte Ergebnis für das Implantat die Kolonisation durch fibrovascular Gewebe innerhalb der Mikroporen Gradienten ohne Restenose und der Bildung der inneren Auskleidung Flimmerepithelzellen auf den Polyelektrolyt.
Eine Möglichkeit zur Kontrolle Integration der Implantate ist es, kleine chirurgische Eingriffe während der die Integration mit dem Host in situ zu tun. Um in der Lage t werdeno entscheiden über den Zeitpunkt der Interventionen, ist es wichtig, Informationen über die systemischen Wirkungen des Implantats haben. C-reaktives Protein (CRP) ist für die Überwachung von Infektionen und entzündlichen Reaktion in klinischen Umgebungen verwendet. Chromogranin A (CGA) können in ähnlicher Weise verwendet werden könnten und genauere Ergebnisse zu liefern, um das Niveau der Entzündung 18 zu beobachten. Als einen möglichen Weg der Beobachtung metallischen Implantat Integration in vivo, präsentieren wir ein kontinuierliches Monitoring-Verfahren des Implantats systemische Effekte durch Charakterisierung von tierischen Blutproben mit Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) und anschließender Protein-Sequenzierung. Ausarbeitung dieser Methode kann verwendet werden, um regelmäßige Endpunkt histologische Analyse entziehen werden. Histologische Schneiden von metallischen Implantaten ist ein langer, umständlich und teuer und kann nur zu bestimmten Zeitpunkten durchgeführt werden. Aus diesem Grund, Bluttests Bereitstellung robuster Informationen über das Implantat Gesundheit gut gestaltete würdemöglich sein, Wege zu Tierversuchen zu verringern, wie durch die jüngsten EU-Vorschriften über Tierversuche vorgeschrieben.
Die hier vorgestellten Methoden können verwendet werden, um die Leistung von metallischen Implantaten durch Funktionalisierung zu verbessern oder um einen alternativen Weg zum Überwachen der vorhandenen Implantate werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pore Steigungen sind wichtige Werkzeuge in der Schnittstelle des Tissue Engineering und der hier beschriebene System kann allein oder in Verbindung mit metallischen Implantaten verwendet werden, um Porengradient bilden Zellwanderung studieren. Das System erfordert keine zusätzliche Einstellung oder zusätzliche Ausrüstung mit Ausnahme einer chemischen Abzugshaube gegen organische Lösungsmittel behandeln, so kann es in der Biologie Labors angewendet werden. Ähnliche Polymere wie Poly (Glykolsäure) (PGA), Poly …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Autoren danken Herrn Dr. Andre Walder und Nicolas Perrin für die Herstellung von Titan-Implantaten, K. Benmlih für den Aufbau der Teflonformen und Dr. G. Prevost danken für seine Hilfe bei Tierversuchen. Wir erkennen auch die Region Elsass und PMNA (Pole Materiaux et Nanowissenschaften d'Alsace) für eine finanzielle Beteiligung.
Materials
| Reagent | |||
| Dioxane | Sigma-Aldrich | 360481 | Toxic material, Strictly under chemical hood |
| PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g |
Sigma-Aldrich | 94829, 81273 | The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent. |
| PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate) | Novamatrix | 4200006 | Low viscosity(20-200 mPa.s) |
| Collagen type I (Bovine) | Symatese | CBPE2US100 | |
| Pen/Strep, Fungizone | Promocell | C42020 | |
| Genipin | Wako | 0703021 | |
| Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1. | Bruker | MSCT | |
| Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0% | Sigma-Aldrich | 302031 | Hazardous Material, Please follow MSDS carefully |
| Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9% | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | C3100MP | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit | Genway Bio | GWB-9BF960 | |
| DMSO, Bioreagent, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Equipment | |||
| Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope | Bruker | ||
| Procise microsequencer | Applied Biosystems | ||
| Ultima 3000 HPLC system | Dionex | ||
| Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100 | Hitachi | ||
| Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510 | Zeiss |
Table 1. List of Materials and Reagents.
Riferimenti
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