Metabólica Labeling e Membrana Fracionamento para Comparative Analysis proteômica de<em> Arabidopsis thaliana</em> Culturas suspensão de células

Summary

Aqui, descrevemos um método robusto para o fraccionamento das membranas plasmáticas de plantas solúveis em membranas resistentes a detergente e do detergente baseado numa mistura de não marcado e in vivo totalmente ^{15 n} marcadas culturas de células de Arabidopsis thaliana. O procedimento é aplicado para estudos de proteômica comparativas para compreender os processos de sinalização.

Abstract

Microdomínios de membrana de plasma são características baseadas nas propriedades físicas do ambiente de lípido e de esteróis e tem funções particulares em processos de sinalização. Extraindo microdomínios de membrana enriquecidos com esteróis a partir de células de plantas para análise proteômica é uma tarefa difícil, devido principalmente a várias etapas de preparação e fontes de contaminação de outros compartimentos celulares. A membrana plasmática consiste apenas cerca de 5-20% de todas as membranas de uma célula de planta, e, por conseguinte, o isolamento da fracção de membrana de plasma altamente purificado é um desafio. Um método frequentemente utilizado envolve a partição aquosa em duas fases em polietileno-glicol e dextrano, que produz vesículas da membrana de plasma com um grau de pureza de 95% ^1. Microdomínios membrana rica em esteróis na membrana plasmática são insolúveis mediante tratamento com detergentes não iónicos a frio a um pH alcalino. Esta fracção membranar resistente a detergente podem ser separados a partir da membrana do plasma por ultracentrifugação, em grandes quantidades, comogradiente ucrose ^2. Subsequentemente, as proteínas podem ser extraídas a partir da banda de baixa densidade do gradiente de sacarose por precipitação de metanol / clorofórmio. Proteína extraída irá então ser digerido com tripsina, dessalinizada e finalmente analisadas por LC-MS/MS. Nosso protocolo de extração de microdomínios ricos em esteróis é otimizado para a preparação de frações de membrana detergente limpa-resistente de culturas de células de Arabidopsis thaliana.

Usamos a marcação metabólica completa de Arabidopsis thaliana as culturas de células em suspensão com K ¹⁵ NO ₃ como a única fonte de nitrogénio para os estudos de proteómica comparativa quantitativa após o tratamento biológico de interesse ^3. Ao misturar proporções iguais de culturas de células marcadas e não marcadas para extração de proteínas conjunta a influência de etapas de preparação no resultado quantitativo final é mantido a um mínimo. Além disso a perda de material durante a extracção vai afectar o controlo e as amostras de tratamento da mesma forma, umad por conseguinte, a proporção de luz e péptido alçada irá permanecer constante. No método proposto quer marcado ou não marcado de cultura de células é submetido a um tratamento biológico, enquanto a outra serve de controlo ^4.

Introduction

Em 1972, Jonathan Singer e Garth Nicolson propôs o modelo de mosaico fluido um modelo de estrutura das membranas celulares, substituindo o modelo sanduíche proteína-lipídio-proteína que foi geralmente aceite no início de 1960. Singer e Nicolson postulado que a membrana biológica pode ser considerada como um líquido bidimensional em que todas as moléculas de lípidos e de proteínas difundem-se livremente e facilmente ^5. Desde essa altura, o modelo de estrutura da membrana do plasma e do conhecimento da composição de membrana tornaram-se ainda mais complexo. Particularmente, dentro da membrana do plasma, tais como estruturas de complexos de proteínas e de lípidos com base / esterol microdomínios estruturalmente desordenados pode ser observada. Em membranas modelo artificiais ^6,7, esteróis e sphingolipids pode lateralmente segregar de outras espécies de lipídios para formar regiões com características físicas alteradas. Esta segregação no interior da membrana celular é causada principalmente pelas propriedades de auto-associação entre esteróis e altamente sacadeias de hidrocarbonetos de turated phopsho-esfingolípidos e ^8. Particularmente, os anéis de esteróis rígidas favorecem as interações com mais aguerrida e espécies de lipídios reto saturadas e essas interações forçar vizinhos cadeias de hidrocarbonetos em mais conformações prolongadas, aumento da espessura da membrana e dureza.

Uma das características comumente observados de esterol enriquecido microdomínios membrana era a sua insolubilidade no tratamento com detergentes não-iónicos de Triton X-100 ou como Brij 35. Essas frações foram pensados ​​para ser idêntico ao microdomínios de membrana e foram chamados de membranas resistentes detergente (DRM) com base em seu método de preparação bioquímica ^2. O uso de detergentes não iônicos durante a extração DRM recebeu algumas críticas como a preparação DRM bioquímico podem não corresponder diretamente a qualquer compartimento de membrana específico dentro da célula viva ^9. Particularmente, a proporção de detergente para a proteína parece ser essencial em tais preparações, umas diferentes detergentes, bem como diferentes quantidades de detergentes pode produzir diferente composição da fracção de membrana resistente a detergente ^10. No entanto, há evidências de que certas espécies de proteína associar especificamente com esses domínios de membrana rica em esteróis celulares, e que estas proteínas são bem enriquecido em preparações bioquímicos das fracções de membrana resistente a detergente ^11. O núcleo de proteínas que foram encontrados na fracção DRM planta, e para as quais a presença de DRM foi esterol dependente, eram particularmente proteínas ancoradas por GPI, tais como proteínas, como a fasciclina-arabinogalactano (AVL) e membros da família de proteínas de SKU. Além disso, algumas proteínas sinalizadoras, como quinases ou fosfolipases receptores do tipo foram encontrados ^11. Estes resultados são consistentes com vários estudos de proteômica em microdomínios de membrana de mamíferos ^12,13. Também em plantas há cada vez mais evidências para o papel de microdomínios de membrana no contexto da resposta ao estresse ^{14 –}16.

O protocolo aqui descrito proporciona um método robusto para fraccionamento de microdomínios da membrana do plasma e em particular utiliza uma proteína com a concentração de detergente que permite descrever as alterações induzidas pelo stress do compartimento da membrana rica em esteróis ^4,11,14.

Protocol

PROCEDIMENTO Reagentes e tampões comuns utilizados no protocolo de extracção: Médio JPL para Arabidopsis thaliana culturas de células em suspensão 3 uM H 3 BO 3 3 uM MnSO4 x H2O 1,1 iM ZnSO4 x 7 H2O 0,15 mM KJ 0,03 uM de Na 2 MoO 4 x 2 H2O 3 nM de CoCl 2 x 6 H 2 O 3 nM de CuS…

Representative Results

Com o protocolo apresentado por meio de culturas de células marcadas metabolicamente Arabidopsis é possível isolar as membranas de plasma a partir de tecidos de plantas (passo 2, as Figuras 2 e 4), e enriquecer por fracções de membrana resistente a detergente no interior da membrana plasmática (passo 3, as Figuras 3 e 5). Subsequentemente, o protocolo permite a extracção de proteínas a partir destas fracções de membrana resistente a detergentes (passo 4) e de digest?…

Discussion

O protocolo apresentado neste artigo contém muitas etapas e todos eles são cruciais para a obtenção de fracionamento pura e representante da membrana plasmática da planta em membranas resistentes detergente e frações solúveis detergentes. Portanto, é importante seguir cada passo as instruções.

O tratamento da fracção da membrana de plasma com um detergente não-iónico (passo 3.2) tem a maior influência sobre a qualidade da membrana microdomínio fraccionamento. Para obter resu…

Materials

			REAGENTS
Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise
Ammonia (stock 25 % solution)	WAKO	010-03166
TiO2 10 μm	GL-Science	5020-75010
Empore Disk C18	Varian	12145004
Polyethylene glycol(PEG 3350)	Sigma	88276
Dextran T500	Roth	9219.2
Trypsin	Promega	V5113
Protease inhibitor cocktail (PIC)	Sigma	P9599
K15NO3	Cambridge Isotope Laboratories	NLM-765-PK
			EQUIPMENT
Optima L-80 XP Ultracentrifuge	Beckman
Plate reader	BioTek
EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph	Thermo Scientific
LTQ-Orbitrap mass spectrometer	Thermo Scientific
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Centrifuge 5417R	Eppendorf
Thermomixer	Eppendorf
Speed Vac RVC 2-25	Christ
Shaker Unimax 2010	Heidolph