Het beoordelen van verschillen in sperma concurrerend vermogen in<em> Drosophila</em

Summary

Differentiële sperma concurrerend vermogen onder<em> Drosophila</em> Mannen met verschillende genotypen kan worden vastgesteld door middel van dubbel-paring experimenten. Elk van deze experimenten betreft een van de mannetjes van belang en een verwijzing mannetje. Gemakkelijk herkenbaar markers in het nageslacht kunnen gevolgtrekking van de fractie van individuen verwekt door elke man.

Abstract

De concurrentie tussen soortgenoten mannen voor bemesten de eicellen is een van de mechanismen van seksuele selectie, namelijk selectie die opereert op het maximaliseren van het aantal geslaagde paring gebeurtenissen eerder dan op het maximaliseren van de overleving en de levensvatbaarheid ^1. Spermacompetitie vertegenwoordigt de concurrentie tussen mannetjes na copuleren met hetzelfde vrouwtje ^2, waarbij het ​​sperma zijn toevallig in tijd en ruimte. Dit fenomeen is vastgesteld in meerdere soorten planten en dieren ^3. Bijvoorbeeld, wildvang D. melanogaster vrouwtjes bevatten meestal sperma 2-3 mannetjes ^4. De zaadcellen worden opgeslagen in gespecialiseerde organen met een beperkte opslagcapaciteit, die kunnen leiden tot de directe concurrentie van het sperma van verschillende mannetjes ^2,5.

Het vergelijken van sperma concurrerend vermogen van verschillende mannetjes van belang (experimentele mannelijke types) is uitgevoerd door middel van gecontroleerde dubbel-paring experimentelets in het laboratorium ^6,7. In het kort wordt een enkele vrouwelijke blootgesteld aan twee verschillende mannetjes achter elkaar, een experimenteel mannetje en een cross-paring verwijzing mannetje. Hetzelfde paring regeling wordt dan gevolgd met behulp van andere experimentele mannelijke types bevordert zo het indirecte vergelijking van het concurrerend vermogen van hun sperma door middel van een gemeenschappelijk referentiekader. De fractie van individuen verwekt door de experimentele en referentie-mannetjes wordt geïdentificeerd met behulp van markers, die een tot schatten sperma concurrerend vermogen met behulp van eenvoudige wiskundige uitdrukkingen ^7,8. Daarnaast kan sperma concurrerend vermogen worden geschat op twee verschillende scenario's, afhankelijk van de vraag of de experimentele man is de tweede of eerste stuurman (aanval en verdediging assay, respectievelijk) ^9, waarin wordt aangenomen dat een afspiegeling is van de verschillende bevoegdheden attributen.

Hier beschrijven we een aanpak die helpt om de rol van verschillende genetische factoren die vermoedelijk ten grondslag liggen t ondervragenHij fenomeen van sperma concurrerend vermogen in D. melanogaster.

Introduction

Sinds Geoff Parker merkte de prevalentie van sperma concurrentie bij insecten en de evolutionaire implicaties ^2, hebben een golf van studies in Drosophila en andere soorten geprobeerd om wat licht te werpen op dit fenomeen op veel verschillende niveaus. Enkele voorbeelden van gebieden die van belang zijn het onderzoek van de variatie is in natuurlijke populaties ^9,10, zijn genetische architectuur en de relevantie van de onderliggende genetische factoren ^11-14, en zijn rol in het besturen van co-evolutie tussen de seksen ^15,16. In D. melanogaster vrouwtjes, de beperkte capaciteit van de gespecialiseerde sperma-opslag organen, een paar spermatheca en de rudimentaire bakje ^6,17, draagt ​​bij aan de concurrentie van het sperma van verschillende mannetjes. Ongeveer 1.500 sperma Overdracht paring de vrouwelijke maar ~ 500 kunnen worden ondergebracht in de genoemde organen ^18,19. In het laboratorium, gecontroleerde dubbel-paring ervaringmenten met een verwijzing mannelijke en een of meer mannetjes van belang zijn uitgebreid gebruikt voor het evalueren van het sperma concurrerend vermogen ^7,8.

Sperma concurrerend vermogen wordt geschat als het aandeel van de nakomelingen verwekt door de experimentele mannen in double-paring experimenten over de totale nageslacht, dat wil zeggen dat zowel de experimentele-en referentie-mannetjes. Sperma concurrerend vermogen bestaat uit twee gedeelten, die elk in een afzonderlijke test geëvalueerd. In de overtreding test het vermogen van de experimentele mannelijke sperma om de sperma van de eerste mannelijke verplaatsen, dat wil zeggen de referentie mannetje, wordt geëvalueerd. Omgekeerd in de verdediging assay, het vermogen van de experimentele mannelijke zaadcellen verplaatsing weerstaan ​​of de bevruchting succes van de referentie mannelijke zaadcellen verminderen geëvalueerd. Afhankelijk van het type test, de verdediging of aanval, wordt het sperma concurrerend vermogen geschat door de scores P ₁ of P _2, respectievelijk. P₁ en _P2 slechts waarden tussen 0 en 1 aannemen. Tussenliggende waarden worden meestal geïnterpreteerd als indirect bewijs van sperma mengen, die een fysiologische scenario van directe spermaconcurrentie suggereert. Volgens dezelfde redenering, kan extreme waarden worden geïnterpreteerd als bewijs voor een sterke differentiële sperma concurrerend vermogen. Vroege studies toonden aan dat P ₂ di D. melanogaster is dan 0,8 toe als de tijd tussen de twee paringen verlengt ^7. Dezelfde experimentele ontwerp is gebruikt in andere Drosophila species, P ₂ de gebruikte statistiek in studies om sperma concurrerend vermogen ²⁰ evalueren. Voor de meeste soorten de _P2 waarden van de geteste stammen is hoger dan 0,6 ^21. Toch kunnen een aantal andere mechanismen los van de directe concurrentie tussen sperma van verschillende mannetjes identieke scores (zie Overleg) opleveren.

Distinguishing nakomelingen verwekt door de eerste of tweede mannetjes is mogelijk door het gebruik van gemakkelijk herkenbare markeringen. In vroege studies, een van de mannetjes werd bestraald subletale doses, bijvoorbeeld X-stralen zodanig dat vrijwel alle eicellen bevrucht door sperma bestraalde niet uitkomen ^7. Vervolgens hebben mutaties veranderen oogpigmentatie of vleugelvorm de meest gebruikte markers geweest. Voorbeelden van de eerste zijn de mutaties bw (bruin) ^9, cn (cinnaber) ²² en w (wit) ^23, terwijl de mutatie Cy (Curly) ²⁴ komt overeen met het tweede type van fenotypes, een aantal van deze mutaties zijn gecombineerd in de dezelfde persoon, bijvoorbeeld cn bw. In mindere mate zijn allozymes ²⁵ en microsatellieten ^26,27 met bekende overerving patronen ook gebruikt.

Proefopzet te testen voor verschillen insperma concurrerend vermogen hier beschreven volgt in wezen dat van Clark et al.. ^9. Resultaten verkregen uit deze experimenten geven informatie uitsluitend over de differentiële vaderschap van de experimentele mannelijke types onder de loep. Testen die ook rekening te houden met post-bevruchting verschillen in geschiktheid ^14,28 en zaadcellen visualisatietechnieken ²⁴ kunnen verschillen in P ₁ (of P ₂₎ scores worden geïnterpreteerd als verschillen in sperma competentie.

Figuur 1 schetst de beweegredenen van zowel de aanval en de verdediging assays. Om de logistiek van het proces te illustreren, een overtreding experiment in D. uitgevoerd melanogaster ¹⁴ zal in detail worden toegelicht. Deze bijzondere overtreding assay werd gebruikt voor het testen van een meetbaar effect van de multigenfamilie Sperma-specifieke dynein tussenketen (SDIC) op sperma concurrerend vermogen. Alle lids van deze multigenfamilie wonen in tandem op het X-chromosoom. Knockout mannen werden gegenereerd door het schrappen van de SDIC cluster. Omdat het verwijderde segment ook het essentieel gen korte vleugel (sw) en het doel van de studie was om de relevantie van SDIC evalueren, werden mannetjes dragen van de SDIC-sw verwijdering gered door een transgene kopie van sw (gesymboliseerd als P {sw} , die ook droeg een mini-witte reportergen) op chromosoom 2. Kleur oog werd gebruikt als een zichtbare merker voor identificatie vaderschap. Alle vliegen waren in een witte achtergrond mutant met uitzondering van die van de stam Oregon-R, die werden gebruikt als referentie mannen.

Protocol

Kleinschalige experimenten moeten worden uitgevoerd om vertrouwd te raken met de hele procedure geworden. 1. Verzamelen Virgin Vrouwtjes en Naïve Males De eenvoudigste versie van de beschreven experiment bestaat uit vier initiële kruisen, die de volgende combinatie van volwassenen omvatten: a) w 1118 individuen om maagdelijke vrouwtjes verzamelen; b) Oregon-R individuen om naïeve mannetjes referentie verzamelen; c ) P {sw} homozygote…

Representative Results

Tabel 2 geeft een aantal opvallende kenmerken van twee misdrijf experimenten (Testen 1 en 2), waarin D. melanogaster experimentele mannen met en zonder (type I en II, respectievelijk) een functionele sdic cluster vergeleken 14. Rekening houdend met de verschillende voorvallen ondervonden met enkele herhalingen werd 58-83% van de vrouwen bevonden informatief en derhalve de graven vaderschap van hun nageslacht kunnen worden berekend P2. Resultaat van niet-parametris…

Discussion

We hebben de proefopzet beschreven verschillen in de relatieve bijdrage van genetisch onderscheiden beoordelen D. melanogaster mannetjes aan het nageslacht in gecontroleerde dubbel-paring experimenten ^7,8. Dit is gedaan in de context van een genetische factor hypothese sperma concurrentievermogen beïnvloeden en het is getoond in het feit assay hoewel een soortgelijke procedure geldt voor de verdediging assay (figuur 1). Deze experimentele ontwerp kan worden aangepast aan andere aspe…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Amber latex tubing	VWR	62996-473	1/4 inch ID, 1/6 inch Wall
1 ml graduated XL filter tips	USA Scientific	1126-7810	Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed
Parafilm	Sigma	P-7793
Mesh Fabric			Thin and smooth
Stereomicroscope	Leica	S6D
CO2 Tank	Airgas	CD-50	Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available
FlyStuff Foot Valve, complete system	Genesee Scientific	59-121C	Not necessary if FlyNap is used
Plastic vials	Genesee Scientific	32-109	Come with carboard trays that can be reused for holding vials
Cotton balls	Fisher Scientific	AS-212
Active dry yeast	Red Star		Found in general grocery store
Sharpie markers			Different colors may be used for marking different genotypes