Avaliar as diferenças na capacidade competitiva do esperma em<em> Drosophila</em

Summary

Diferencial esperma capacidade competitiva entre<em> Drosophila</em> Homens com genótipos diferentes pode ser verificada através de experimentos double-acasalamento. Cada uma dessas experiências envolve um dos homens de interesse e um homem de referência. Marcadores facilmente identificáveis ​​na progênie permitem inferir da fração de indivíduos filhas de cada macho.

Abstract

A competição entre os machos conspecíficas para fertilizar os óvulos é um dos mecanismos de selecção sexual, isto é, selecção que opera sobre a maximização do número de eventos de acasalamento bem-sucedido em vez de maximizar a sobrevivência e viabilidade ^1. Competição do esperma representa a competição entre os machos depois da cópula com a mesma fêmea ^2, no qual o esperma são coincidentes no tempo e no espaço. Este fenómeno tem sido relatada em diversas espécies de animais e plantas ^3. Por exemplo, selvagens capturados D. fêmeas melanogaster geralmente contêm esperma 2-3 ⁴ machos. Os espermatozóides são armazenados em órgãos especializados, com capacidade de armazenamento limitada, o que pode levar à concorrência directa do esperma de diferentes homens ^2,5.

Comparando esperma capacidade competitiva de machos diferentes de interesse (tipos masculinos experimentais) foi realizada por meio de experimentação controlada double-acasalamentots no laboratório ^6,7. Resumidamente, uma única fêmea está exposto a dois machos diferentes consecutivamente, um macho experimental e uma referência masculina cross-acasalamento. O mesmo esquema de cruzamento é seguida usando outros tipos masculinos experimentais, facilitando assim a comparação indireta da capacidade competitiva de seu esperma através de uma referência comum. A fração de indivíduos filhas de os experimentais e de referência do sexo masculino é identificado por meio de marcadores, o que permite estimar a capacidade competitiva de espermatozóides usando expressões matemáticas simples ^7,8. Além disso, a capacidade competitiva do esperma pode ser estimado em dois cenários diferentes dependendo se o macho experimental é o segundo ou primeiro a mate (ataque e defesa ensaio, respectivamente) ^9, que se supõe ser o reflexo de diferentes atributos de competência.

Aqui, descrevemos uma abordagem que ajuda a interrogar o papel dos diferentes fatores genéticos que supostamente sustentam tele fenômeno da capacidade competitiva do esperma em D. melanogaster.

Introduction

Desde Geoff Parker observou a prevalência de competição do esperma nos insetos e suas implicações evolucionárias ^2, uma onda de estudos em Drosophila e outras espécies têm tentado lançar alguma luz sobre este fenômeno em muitos níveis diferentes. Alguns exemplos de áreas de interesse foram o levantamento de sua variação em populações naturais ^9,10, sua arquitetura genética e relevância de fatores genéticos subjacentes ^11-14, e seu papel na condução de co-evolução entre os sexos ^15,16. Em D. melanogaster fêmeas, a capacidade limitada dos órgãos de armazenamento de esperma especializados, um par de espermateca e receptáculo seminal ^6,17, contribui para a competição do esperma de diferentes homens. Aproximadamente 1.500 esperma são transferidos durante o acasalamento à fêmea, mas apenas ~ 500 podem ser acomodados nos órgãos referidos ^18,19. No laboratório, controlada acasalamento dupla experimentos envolvendo um homem de referência e um ou mais machos de juros têm sido amplamente utilizados para avaliar a capacidade competitiva do esperma ^7,8.

A capacidade competitiva de esperma é estimada como a percentagem de crias desejado pelo macho experimental nas experiências de acasalamento-duplo ao longo da descendência total, ou seja, que tanto do sexo masculino de referência e experimental. A capacidade competitiva de esperma compreende dois componentes, cada um deles avaliada num ensaio separado. No ensaio de ataque, a capacidade do esperma do homem experimental para deslocar o esperma do primeiro macho, ou seja, o macho de referência, é avaliada. Por outro lado, no ensaio de defesa, a capacidade do esperma do homem experimental para resistir deslocamento ou para reduzir o sucesso da fertilização do espermatozóide referência é avaliada. Dependendo do tipo de ensaio, a defesa ou ofensa, capacidade competitiva de esperma é estimado através dos pontos P ₁ ou P _2, respectivamente. P₁ e P ₂ só pode assumir valores entre 0 e 1. Os valores intermediários são geralmente interpretados como evidência indireta de esperma de mistura, o que sugere um cenário fisiológico que envolve a competição do esperma direto. Seguindo o mesmo raciocínio, valores extremos pode ser interpretado como evidência de forte diferencial esperma capacidade competitiva. Estudos anteriores mostraram que a P ₂ em D. melanogaster é acima de 0,8, como o aumento do tempo decorrido entre os dois cruzamentos prolonga ^7. Este mesmo modelo experimental foi usado em outras espécies de Drosophila, P ₂ ser a estatística utilizada em estudos para avaliar a capacidade competitiva de esperma ^20. Para a maioria das espécies, os valores das _duas estirpes testadas P é superior a 0,6 ^21. No entanto, vários outros mecanismos não relacionados à concorrência directa entre espermatozóides de diferentes machos podem produzir notas idênticas (ver discussão).

Dprogenitura istinguishing desejado pelos primeiros ou segundos machos é possível através do uso de marcadores facilmente identificáveis. Em estudos iniciais, um dos machos foi irradiada com doses subletais de, por exemplo, raios X, que praticamente todos os óvulos fertilizados por esperma irradiado não eclodiram ^7. Posteriormente, as mutações que alteram a pigmentação dos olhos ou forma de asa foram os marcadores mais usados. Os exemplos do anterior são as mutações pv (castanho) ^9, CN (cinábrio) e ²² W (branco) ^23, enquanto que a mutação CY (encaracolado) ²⁴ corresponde ao segundo tipo de fenótipos, alguns destas mutações foram combinadas no mesmo indivíduo, por exemplo, cn bw. Em menor medida, isoenzimas ²⁵ e ^26,27 microssatélites com padrões de herança conhecidos também têm sido utilizados.

O delineamento experimental para testar as diferenças decapacidade competitiva esperma descrito aqui segue essencialmente o de Clark et al. ^9. Os resultados obtidos a partir desses experimentos dar informações apenas sobre a paternidade diferencial dos tipos masculinos experimentais sob escrutínio. Ensaios que também fazem provisão para diferenças pós-fertilização na aptidão ^14,28 e técnicas de visualização de esperma ²⁴ permitir diferenças de P ₁ (ou P ₂₎ marca a ser interpretado como diferenças na competência do esperma.

A Figura 1 descreve a lógica tanto da ofensa e os ensaios de defesa. Para ilustrar a logística do processo, uma ofensa experimento realizado em D. melanogaster ^14, será explicada em detalhe. Este ensaio ofensa particular foi usado para testar um efeito mensurável do multigene família cadeia intermediária dynein específico Sperm (Sdic) sobre a capacidade competitiva do esperma. Todos os Estados-s desta família multigene residem em conjunto no cromossomo X. Homens Knockout foram geradas, suprimindo o cluster Sdic. Porque o segmento excluído também incluiu o essencial curto asa gene (sw) eo objetivo do estudo foi avaliar a relevância de Sdic, os homens portadores da deleção Sdic-sw foram resgatados por uma cópia transgênica do sw (simbolizado como P {sw} , que também realizado um mini-gene repórter de branco) no cromossoma 2. Cor dos olhos foi usado como um marcador visível para identificação de paternidade. Todas as moscas estavam num fundo branco mutante com a excepção daqueles a partir da estirpe de Oregon-R, que foram usadas como referência para os machos.

Protocol

Experimentos em pequena escala deve ser realizada para se familiarizar com todo o processo. 1. Coleta de fêmeas e machos virgens Naïve A versão mais simples do experimento descrito é composto por quatro tipos de cruzamentos iniciais, que envolvem a seguinte combinação de adultos: a) w 1.118 indivíduos, a fim de coletar fêmeas virgens, b) Oregon-R indivíduos, a fim de recolher os machos de referência ingênuos, c ) P {sw} macho…

Representative Results

A Tabela 2 resume algumas características marcantes de dois experimentos de ofensa (Ensaios 1 e 2), em que D. melanogaster machos experimentais com e sem (tipo I e II, respectivamente), um cluster Sdic funcional são comparados 14. Depois de levar em conta as diferentes incidências encontradas com algumas repetições 58-83% das mulheres foram encontrados para ser informativo e, portanto, as contagens de paternidade de seus descendentes poderiam ser usados ​​para o cá…

Discussion

Nós descrevemos o projeto experimental para avaliar as diferenças na contribuição relativa de organismos geneticamente distinto D. melanogaster machos à progênie em experimentos controlados duplo-acasalamento ^7,8. Isto foi realizado no contexto de um factor genético hipótese de influenciar a capacidade competitiva do esperma e que tenha sido ilustrada no ensaio de ataque, embora um procedimento semelhante aplica-se ao ensaio de defesa (Figura 1). Esta concepção experimental…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Amber latex tubing	VWR	62996-473	1/4 inch ID, 1/6 inch Wall
1 ml graduated XL filter tips	USA Scientific	1126-7810	Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed
Parafilm	Sigma	P-7793
Mesh Fabric			Thin and smooth
Stereomicroscope	Leica	S6D
CO2 Tank	Airgas	CD-50	Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available
FlyStuff Foot Valve, complete system	Genesee Scientific	59-121C	Not necessary if FlyNap is used
Plastic vials	Genesee Scientific	32-109	Come with carboard trays that can be reused for holding vials
Cotton balls	Fisher Scientific	AS-212
Active dry yeast	Red Star		Found in general grocery store
Sharpie markers			Different colors may be used for marking different genotypes