Bedöma Skillnader i spermier konkurrensförmåga i<em> Drosophila</em

Summary

Differential spermier konkurrensförmåga bland<em> Drosophila</em> Män med olika genotyper kan fastställas genom dubbel-parning experiment. Var och en av dessa experiment involverar en av hanarna av intresse och en referens hane. Lätt identifierbara markörer på avkomman tillåter slutsatsen av den fraktion av individer avlade varje hane.

Abstract

Konkurrensen bland conspecific män för gödsling av ägg är en av mekanismerna för sexuell selektion, dvs val som fungerar på att maximera antalet lyckade parning händelser snarare än på att maximera överlevnad och lönsamhet ^1. Spermier konkurrensen utgör konkurrensen mellan hanar efter kopulera med samma kvinnliga ^2, där deras spermier är sammanträffande i tid och rum. Detta fenomen har rapporterats i flera arter av växter och djur ^3. Till exempel, vildfångade D. melanogaster honor brukar innehålla spermier 2-3 hanar ^4. Spermierna lagras i speciella organ med begränsad lagringskapacitet, vilket kan leda till direkt konkurrens av spermier från olika hanar ^2,5.

Jämföra spermier konkurrensförmågan hos olika hanar av intresse (experimentella manliga typer) har utförts genom kontrollerad dubbel-parning experiments i laboratoriet ^6,7. Kortfattat, är en enda kvinna utsätts för två olika hanar i rad, en experimentell manlig och en cross-parning referens hane. Samma parning ordningen följs sedan med andra experimentella manliga typer därigenom underlättar indirekt jämförelse av konkurrensförmågan hos sin sperma genom en gemensam referens. Fraktionen av individer fathered vid de experimentella och referens hanar identifieras med hjälp av markörer, som tillåter en att uppskatta spermier konkurrenskraftig förmåga med hjälp av enkla matematiska uttryck ^7,8. Dessutom kan spermier konkurrensförmåga beräknas i två olika scenarier beroende på om den experimentella manliga är andra eller första att para (offensiv och defensiv analys, respektive) ^9, vilket antas vara reflekterande av olika kompetens attribut.

Här beskriver vi en metod som hjälper till att förhöra betydelsen av olika genetiska faktorer som förmodat bakom than fenomenet spermier konkurrenskraft i D. melanogaster.

Introduction

Eftersom Geoff Parker noterade förekomsten av spermier konkurrensen i insekter och dess evolutionära konsekvenser ^2, har en våg av studier i Drosophila och andra arter som försökte sprida lite ljus över detta fenomen på många olika nivåer. Några exempel på områden av intresse har varit undersökningen av dess variation i naturliga populationer ^9,10, dess genetiska arkitektur och relevans av underliggande genetiska faktorer ^11-14, och dess roll i att driva samevolution mellan könen ^15,16. I D. melanogaster honor, den begränsade kapaciteten hos de specialiserade sperm-lagring organ, ett par spermatheca och sädes behållaren ^6,17, bidrar till att konkurrensen på spermier från olika hanar. Cirka 1.500 spermier överförs under parning till honan men bara ~ 500 kan inrymmas i de nämnda organen ^18,19. I laboratoriet, kontrollerad dubbel-parning erfarenhetningar där en referens hane och en eller flera hanar av intresse har i stor utsträckning använts för att utvärdera spermier konkurrensförmåga ^7,8.

Spermier konkurrensförmåga beräknas som andel av avkomman fallen efter den experimentella manliga i dubbel-parning experiment över den totala avkomman, dvs från både experimentella och män referens. Spermier konkurrensförmåga består av två delar, var och en av dem utvärderas i en separat analys. I brottet analys, förmågan hos experimentella manliga spermier att förskjuta spermier från den första manliga dvs referens manlig, utvärderas. Omvänt, i försvaret analysen, förmågan hos den experimentella manliga spermier motstå förskjutning eller för att minska gödslingen framgång referens manliga spermier utvärderas. Beroende på vilken typ av analys, försvar eller anfall, är spermier konkurrensförmåga uppskattats genom betygsättning P ₁ eller P _2, respektive. P₁ och P ₂ kan endast anta värden mellan 0 och 1. Mellanliggande värden vanligen tolkas som ett indirekt bevis på spermier blandning, vilket antyder en fysiologisk scenario med direkt spermier konkurrens. Enligt samma logik, kan extrema värden tolkas som bevis för en stark differential spermier konkurrensförmåga. Tidiga studier visade att P ₂ i D. melanogaster är över 0,8 ökar som den tid som förflutit mellan de två parningar förlänger ^7. Samma experimentella designen har använts i andra Drosophila arter, P ₂ är den vanligaste statistiken i studier för att utvärdera spermier konkurrensförmåga ^20. För de flesta arter är P ₂ värdena för de testade stammar högre än 0,6 ^21. Ändå kan flera andra mekanismer som saknar samband med den direkta konkurrensen mellan spermier av olika hanar ger samma poäng (se diskussion).

Distinguishing avkomma fallen efter den första eller andra hanar är möjligt genom användning av lätt identifierbara markörer. I tidiga studier, var en av de män bestrålas vid subletala doser av till exempel röntgen så att nästan alla ägg befruktas av bestrålade spermier misslyckades att kläckas ^7. Därefter har mutationer förändrar ögat pigmentering eller vingform varit de mest använda markörerna. Exempel på den förra är mutationerna bw (brun) ^9, cn (cinnober) ²² och w (vit) ^23, medan mutationen Cy (Curly) ²⁴ motsvarar den andra typen av fenotyper, några av dessa mutationer har kombinerats i samma individ, t.ex. cn bw. I mindre utsträckning har allozymes ²⁵ och mikrosatelliter ^26,27 med kända nedärvningsmönster också använts.

Den experimentella designen för att testa för skillnader ispermier konkurrensförmåga beskrivs här följer i huvudsak det av Clark et al. ^9. Resultaten från dessa experiment ger upplysningar endast om skillnaden faderskap av de experimentella manliga typerna under lupp. Analyser som också ta hänsyn till efter gödsling skillnader i fitness ^14,28 och spermier visualiseringstekniker ²⁴ möjliggör skillnader i P ₁ (eller P ₂₎ poäng tolkas som skillnader i spermier kompetens.

Figur 1 visar den logiska grunden för både brottet och analyserna försvar. För att illustrera logistiken i processen, som ett brott experiment i D. melanogaster ¹⁴ kommer att förklaras i detalj. Denna speciella brott analys användes för att testa för en mätbar effekt av multigenfamiljen Sperm-specifik dynein mellanliggande kedjan (sdic) på sperma konkurrensförmåga. Allt medlems av denna multigenfamilj bor i tandem på X-kromosomen. Knockout hanar genererades genom att ta bort sdic klustret. Eftersom den borttagna segment ingår även den essentiella genen korta vinge (SW) och syftet med studien var att utvärdera relevansen av sdic, var män bär sdic-sw deletion räddades av en transgen kopia av sw (symboliserad som P {sw} , som också tog en mini-vit reportergen) på kromosom 2. Ögonfärg användes som en synlig markör för faderskap identifiering. Alla flugor var i en vit mutant bakgrund med undantag för dem från stammen Oregon-R, som användes som referens hanar.

Protocol

Småskaliga experiment bör utföras för att bekanta sig med hela förfarandet. Ett. Samla Virgin Kvinnor och naiva Hanar Den enklaste versionen av den skisserade experimentet består av fyra typer av initiala kors, vilket innebär följande kombination vuxna: A) w 1118 individer i syfte att samla in jungfruliga hondjur, b) Oregon-R individer i syfte att samla naiva referens hanar, c ) P {sw} homozygota hanar och jungfruliga honor frå…

Representative Results

Tabell 2 sammanfattar några framträdande dragen i två brott experiment (Analyser 1 och 2) där D. melanogaster experimentella män med och utan (typ I och II, respektive) en funktionell sdic kluster jämförs 14. Efter att ha tagit hänsyn till olika incidenter påträffas med några replikat, var 58-83% av honorna befunnits vara informativ och därför faderskap räknar av deras avkomma skulle kunna användas för att beräkna P 2. Resultat av icke-parametrisk…

Discussion

Vi har beskrivit den experimentella designen för att bedöma skillnader i den relativa betydelsen av genetiskt distinkta D. melanogaster hanar till avkomman i kontrollerade dubbel-parning experiment ^7,8. Detta har skett inom ramen för en genetisk faktor hypotes att påverka spermier konkurrensförmåga och det har visats inom brottet analysen även om ett liknande förfarande gäller för försvaret analysen (Figur 1). Denna experimentell design kan modifieras för att testa andra …

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Amber latex tubing	VWR	62996-473	1/4 inch ID, 1/6 inch Wall
1 ml graduated XL filter tips	USA Scientific	1126-7810	Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed
Parafilm	Sigma	P-7793
Mesh Fabric			Thin and smooth
Stereomicroscope	Leica	S6D
CO2 Tank	Airgas	CD-50	Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available
FlyStuff Foot Valve, complete system	Genesee Scientific	59-121C	Not necessary if FlyNap is used
Plastic vials	Genesee Scientific	32-109	Come with carboard trays that can be reused for holding vials
Cotton balls	Fisher Scientific	AS-212
Active dry yeast	Red Star		Found in general grocery store
Sharpie markers			Different colors may be used for marking different genotypes