La mejora de la tasa de éxito de cristalización de proteínas por Random Matrix Microseed Screening

Summary

Aquí se describe un método general para la detección de la matriz microseed al azar. Esta técnica se muestra para aumentar de manera significativa la tasa de éxito de la proteína experimentos de cribado de cristalización, reducir la necesidad de optimización, y proporcionar un suministro fiable de cristales para la recopilación de datos y experimentos ligando-spa.

Abstract

Detección matriz microseed aleatorio (RMM) es una técnica de cristalización de proteínas en el que se añaden cristales de siembra a las pantallas de azar. Al aumentar la probabilidad de que los cristales crezcan en la zona metaestable del diagrama de fases de una proteína, cables adicionales de cristalización se obtienen a menudo, la calidad de los cristales producidos se puede aumentar, y se proporciona una buena cantidad de cristales para la recopilación de datos y de remojo experimentos. Aquí se describe un método general para la RMM que se pueden aplicar a cualquiera que se sienta gota o colgando experimentos de difusión de vapor de gota, establecidos ya sea a mano o con la robótica de manipulación de líquidos, en formato de 24 pocillos de la bandeja de 96 pocillos o.

Introduction

Desde su aplicación inicial por Perutz, Kendrew y compañeros de trabajo en la determinación de las estructuras de la hemoglobina y la mioglobina, a los modernos de alto rendimiento tuberías automatizados de la genómica estructural consorcios, cristalografía de rayos X macromolecular nos ha proporcionado una visión estructural sin precedentes en el mundo de la proteína . Esta técnica sigue siendo el método experimental más ampliamente aplicable que permite la visualización directa de la estructura de la proteína en atómica, o cerca de resolución atómica (es decir, en el rango de 1-3). Un requisito previo para la difracción de rayos X para ser aplicado a una proteína es que primero debe ser cristalizado, y es esta etapa del proceso que sigue siendo el paso limitante de la velocidad mayor solo en la determinación de la estructura por métodos de difracción ^{1, 2.} A pesar de los avances significativos en nuestra comprensión del proceso de cristalización de proteínas, y mejoras importantes en la calidad y disponibilidad de pantallas de cristalización,bandejas, y las tecnologías relacionadas, sigue siendo imposible predecir con fiabilidad la probabilidad de éxito de cristalización ^3. Los métodos bioquímicos y biofísicos se pueden aplicar para evaluar si una proteína de interés muestra características favorables para la nucleación y el crecimiento cristalino, es decir, es bien plegada-, homogénea, monodisperso, etc, sin embargo, estos puntos de vista de ninguna manera proporcionan un predictor definitiva de cristalización propensión.

Siembra mucho tiempo se ha pretendido ser un método viable para mejorar el número, el tamaño, y la calidad de los cristales existentes o material cristalino ^4-7. Este enfoque se basa en la premisa de que una condición que soporta la nucleación de cristales puede no ser óptima para posterior crecimiento del cristal y viceversa. Al transferir el material nucleado de una condición a otra, se puede tratar de desacoplar efectivamente estos procesos, dando así acceso a nuevos, el espacio de cristalización todavía inexploradas,y como resultado el aumento de la tasa de éxito general de un experimento de cribado. Los métodos establecidos se han documentado para (i) macroseeding, la transferencia de un solo cristal en su totalidad de una condición a otra ^8, (ii) siembra consecutivas, la transferencia de material nucleado, generalmente obtenido por la aplicación de presión direccional utilizando, por ejemplo bigote de un gato a la superficie de un cristal existente, seguido de posterior paso de la barba a través de una nueva gota de cristalización ^9, y (iii) microsiembra "clásica", la transferencia de cristal "semillas", generados por la recolección aplastado cristales (o cristalina materiales), en condiciones similares a las que se produjeron las semillas ^10. Cabe destacar que los tres de estos métodos son mucho tiempo y poco escalable, sobre todo en comparación con lo que se puede lograr con modernas robótica cristalización de manejo de líquidos. Estos factores han contribuido, en algún nivel, al menos, a la percepción de que la semillación es un método para ser visitado sólo cuando otros métodos han fallado en dar sus frutos.

Microsiembra matriz aleatoria (RMM) es una innovación metodológica reciente que combina los beneficios de microsiembra tradicional con las de detección y escalabilidad ^11-13 de alto rendimiento. Este enfoque se basa en la generación de una población de semillas, producido a partir de material cristalino nucleada, que puede estar dividió en alícuotas en / sobre cada sub-well/coverslip dentro de una pantalla estándar de cristalización de 96 condiciones. Este método es aplicable a ambos sentados o colgando experimentos de difusión de vapor de gota, establecidos ya sea a mano o con la robótica de manipulación de líquidos, en formato de 96 pocillos de la bandeja de 24 pocillos o. Rmms se ha demostrado experimentalmente para aumentar significativamente la tasa de éxito de cristalización, y producir cristales de mayor calidad y la cantidad ^{11, 13, 14} de difracción, y representa una herramienta innovadora en el arsenal de los cristalógrafos 'de enfoques en el ONgoing esfuerzo hacia el éxito de la cristalización. Aquí se describe un método general para RMM y proporcionar datos de ejemplo que ilustran la eficacia de esta técnica.

Protocol

1. Consideraciones Estratégicas La elección de las semillas-cristales utilizado para los experimentos de microsiembra variará dependiendo del objetivo del experimento. Al inicio de un proyecto es de gran ayuda para encontrar varios éxitos de cristalización que pueden proporcionar puntos de partida alternativos para la optimización de cristal. Rmms reduce en gran medida la necesidad de optimización de cristal porque los cristales de buena calidad son más propensos a crecer en la zona metaestable del di…

Representative Results

(A) Ejemplo de un experimento Rmms Para demostrar la eficacia del cribado Rmms aplicamos este método para la cristalización de huevo de gallina lisozima (HEWL) y el hígado de bovino catalasa (BLC). Tanto estas enzimas son eminentemente cristalizable y están estructuralmente objetivos 15, 16 bien caracterizados. Como tal ambos proporcionan excelentes sujetos de prueba con los que ilustrar la mayor tasa de éxito cristalización alcanzable con RMM. Experimentos de cristalización s…

Discussion

En este trabajo se ha descrito un método general para la detección de la cristalización de proteínas RMM. Hemos demostrado el uso de dos proteínas de prueba una mejora significativa en la tasa de éxito de cristalización usando este método. El análisis de difracción usando radiación de sincrotrón de un subconjunto de cristales generados usando Rmms y métodos no Rmms reveló poca variación en la calidad de difracción entre cristales crecidos usando cualquiera de los métodos, aunque los autores anteriores h…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
MRC 96 well crystallization trays	Molecular Dimensions Ltd	MD11-00-100	Non-UV compatible, for screens established by robot
ClearView sealing sheets	Molecular Dimensions Ltd	MD6-01S
Hen egg white lyzozyme	Sigma-Aldrich	L6876	~95% purity
Bovine liver catylase	Sigma-Aldrich	C9322	>95% purity
Xylanase	Hampton Research	HR7-104
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii	Sigma-Aldrich	T7630
Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko	Sigma-Aldrich	P1512
JCSG-plus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-40	For screens established by robot
PACT premier HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-36	For screens established by robot
Morpheus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-47	For screens established by robot
Crystal Phoenix liquid handling system	Art Robbins Instruments	602-0001-10
Seed bead kit	Hampton Research	HR2-320
Binocular stereo microscope	Leica	M165C
Scalpel blades	Sigma-Aldrich	S2646-100EA
ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette	Starlab	S7100-0125
ErgoOne 2-20 μl pipette	Starlab	S7100-0221
ErgoOne 100-1000 μl pipette	Starlab	S7100-1000
JCSG-plus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-37	For screens established by hand
PACT premier screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-29	For screens established by hand
Morpheus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-46	For screens established by hand
Tweezers	Sigma-Aldrich	T5415-1EA
CrystalClene coverslips 18 mm	Molecular Dimensions Ltd	MD4-17
2 ml glass Pasteur pipettes	Sigma-Aldrich	Z722669
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-360
24 well XRL crystallization tray	Molecular Dimensions Limited	MD3-11	For screens established by hand
30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0