Isolement, la purification et l'étiquetage des neutrophiles osseuse de souris de moelle pour les études fonctionnelles et expériences de transfert adoptif

Summary

Nous décrivons un protocole pour l'isolement et la purification des neutrophiles de la moelle osseuse de souris par centrifugation de gradient de densité et de neutrophiles étiquetage utilisant des colorants CellTracker. Cela représente une méthode simple, rapide, reproductible et économique pour obtenir un grand nombre de neutrophiles pour des études fonctionnelles en aval ou des expériences de transfert et de suivi adoptifs.

Abstract

Les neutrophiles sont des cellules effectrices critiques du système immunitaire inné. Ils sont rapidement recrutés dans les sites d'inflammation aiguë et exercent des effets protecteurs ou pathogènes en fonction du milieu inflammatoire. Néanmoins, en dépit du rôle indispensable des neutrophiles dans l'immunité, la compréhension détaillée des facteurs moléculaires qui interviennent effets effectrices et immunopathogène de neutrophiles dans différentes maladies infectieuses et les affections inflammatoires qui manque encore, en partie en raison de leur courte demi-vie, les difficultés de manipulation de ces cellules et du manque de protocoles expérimentaux fiables pour obtenir un nombre suffisant de neutrophiles pour des études fonctionnelles en aval et des expériences de transfert adoptif. Par conséquent, des méthodes simples, rapides, économiques et fiables sont hautement souhaitables pour récolter un nombre suffisant de neutrophiles de souris pour évaluer les fonctions telles que la phagocytose, le meurtre, la production de cytokines, la dégranulation et la traite. À cette fin,Nous présentons une densité protocole centrifugation basée reproductible gradient, qui peut être adapté à n'importe quel laboratoire d'isoler un grand nombre de neutrophiles à partir de la moelle osseuse de souris avec une grande pureté et sa viabilité. En outre, nous présentons un protocole simple qui utilise des colorants CellTracker d'étiqueter les neutrophiles isolés, qui peuvent ensuite être adoptive transférés dans des souris receveuses et suivis dans plusieurs tissus pendant au moins 4 heures post-transfert en utilisant la cytométrie de flux. En utilisant cette approche, le différentiel étiquetage des neutrophiles des souris de type sauvage et le gène déficient avec différents colorants CellTracker peut être employée avec succès pour réaliser des études de repeuplement compétitifs pour évaluer le rôle direct de gènes spécifiques dans le trafic des neutrophiles dans le sang dans les tissus cibles in vivo .

Introduction

Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants chez les humains. Ils sont la principale composante cellulaire du système immunitaire inné et agissent comme première ligne de défense contre les micro-organismes envahisseurs. Les patients présentant une neutropénie acquise et immunodéficiences primaires qui affectent nombre de neutrophiles et / ou la fonction développent des infections bactériennes et fongiques invasives potentiellement mortelles, en soulignant l'importance de ces cellules en défense de l'hôte ^1. Reconnaissance immunitaire des pathogènes envahissants sur le site de l'infection par leurs parentes de reconnaissance des formes récepteurs résulte en l'induction d'une orchestrée réponse immunitaire innée, ce qui conduit à une sécrétion de chemoattractants qui génèrent un gradient chimiotactique capable de recruter des neutrophiles de la circulation sanguine dans les tissus enflammés ² . Après neutrophiles entrer dans le site de l'infection, ils deviennent activées, ce qui conduit à des cytokines et chimiokines production, l'absorption des agents pathogènes, et tuant par moi oxydative et non oxydativecanismes ^3. Outre leur rôle bien connu dans l'immunité innée, neutrophiles ont également été montré récemment à jouer des rôles importants comme initiateurs de réponses immunitaires adaptatives efficaces ^4. D'autre part, en dehors de leur rôle de protection de l'immunité, les neutrophiles peuvent également arbitrer des lésions tissulaires et immunopathologie due à l'accumulation excessive et / ou l'activation des sites d'inflammation, comme le montre une variété de maladies infectieuses et auto-immunes ^5-7.

En dépit du rôle indispensable des neutrophiles dans le montage réponses immunitaires innées efficaces et leurs fonctions effectrices pléiotropiques dans plusieurs maladies infectieuses et les affections inflammatoires, les difficultés techniques avec la manipulation de ces cellules et l'absence de protocoles expérimentaux fiables a entravé la recherche avec des neutrophiles au cours des dernières décennies. Par conséquent, l'utilisation de tests reproductibles pour l'isolement des neutrophiles devrait faciliter la recherche sur médiée par les neutrophiles immunologiquesgique fonctions ex vivo et in vivo. A ce jour, plusieurs méthodes ont été décrites pour l'isolement de cellules neutrophiles telles que centrifugation en gradient de densité du sang humain et du sang de souris ou de moelle osseuse ^8,9, enrichissement immunomagnétique positif ou négatif des neutrophiles à partir de sang de la souris ou de moelle osseuse ^10,11, et la récolte des neutrophiles de la cavité péritonéale de souris après injection intrapéritonéale de thioglycollate ou d'autres agents anti-inflammatoires ^12. Bien que les neutrophiles peuvent être facilement isolés en grand nombre à partir de sang humain, cette méthode n'est pas optimale chez la souris en raison du volume limité de sang de souris qui empêche l'isolement des neutrophiles suffisantes pour des études fonctionnelles ou des expériences de transfert adoptif ^13. En outre, bien que le rendement de thioglycolate cellules de la cavité péritonéale est supérieure par rapport à celle du sang de la souris, la pureté des neutrophiles dans le lavage péritonéal inflammatoire varie entre60 à 90%, et les neutrophiles isolées présentent un phénotype activé. Ainsi, les cellules recueillies en utilisant cette méthode ne peut être utilisée pour effectuer des études fonctionnelles activé mais pas de neutrophiles non stimulés, comme la cavité péritonéale de souris a peu de neutrophiles à l'état stationnaire ^12. Au lieu de cela, la moelle osseuse est un réservoir commode pour récolter un grand nombre de neutrophiles soit non stimulés ou activés ^11,14, qui peuvent ensuite être utilisés pour des études fonctionnelles en aval tels que la phagocytose, le meurtre et la dégranulation, ou pour le transfert adoptif dans des souris receveuses.

Ici, nous décrivons un moyen simple et rapide (~ 2 h), ce qui présente un rendement élevé (~ 6-12 × 10 ⁶ neutrophiles / souris non infectées, soit jusqu'à 30-40 × 10 ⁶ neutrophiles / souris infectées) de pur (80 -95%) avec les neutrophiles> 95% la viabilité de la moelle osseuse. Cette méthode utilise Histopaque disponible dans le commerce, qui sont séparés densité cellulaire de gradientmédias de rations composées de Ficoll et diatrizoate de sodium, afin de séparer les neutrophiles de la moelle osseuse de souris. Cette méthode donne beaucoup plus grand nombre de neutrophiles par la souris par rapport au sang ou à cavité péritonéale, il peut être utilisé pour collecter des neutrophiles de souris à la fois à l'état d'équilibre ou après l'infection, et il est plus facile de couche par rapport à la méthode de centrifugation de gradient de densité qui utilise discontinue gradients de Percoll composé de 55% / 65% / 75% Percoll dans PBS ^9. En outre, le temps et les ressources nécessaires pour recueillir les neutrophiles purs sont sensiblement diminué par rapport à l'isolement des neutrophiles par tri cellulaire activé par fluorescence. Aussi, parce que cette méthode n'implique pas une étape d'enrichissement immunomagnétique, il est plus rentable, et il évite l'exposition des cellules à la colonne magnétique et des anticorps, diminuant ainsi la probabilité d'activation des neutrophiles.

En plus d'effectuer des études fonctionnelles de neutroph isoléILS ex vivo et le transfert adoptif de cellules dans des souris receveuses, ce protocole décrit également un procédé de marquage des neutrophiles isolés à l'aide de différents colorants CellTracker. Différentiel étiquetage des neutrophiles des souris de diverses origines génétiques peut être adapté à des études de repeuplement compétitifs pour le suivi des neutrophiles transférés dans les tissus des souris receveuses par cytométrie en flux, qui peuvent fournir une approche mécanistique sur le rôle direct de gènes spécifiques dans le trafic des neutrophiles dans le sang en cibles organes enflammés ^6.

Protocol

1. Isolement de souris cellules de moelle osseuse Euthanasier les souris en utilisant le protocole de soin des animaux de l'institution comité approuvé et vaporiser la surface des animaux avec de l'éthanol à 70%. Faire une incision de la peau dans le milieu de l'abdomen et enlever la peau de la partie distale de la souris, y compris la peau qui recouvre les extrémités inférieures. Coupez les muscles des membres inférieurs à l'aide de ciseaux et disloquer soigneusem…

Representative Results

Ce protocole est optimisé pour la récolte de cellules de moelle osseuse de souris et la séparation subséquente des neutrophiles à partir de ces cellules par centrifugation de gradient de densité à l'aide de médias disponibles dans le commerce de séparation des cellules Histopaque. Neutrophiles isolés en utilisant cette méthode peut être utilisée pour une variété d'aval études fonctionnelles ex vivo et pour les expériences de transfert adoptif de souris receveuses. <p class="jove_con…

Discussion

Ici, nous présentons un protocole fiable, simple, rapide et économique pour l'isolement d'un grand nombre de neutrophiles dans la moelle osseuse de souris avec une grande pureté et de la viabilité en utilisant une approche de centrifugation de gradient de densité. Lorsque ce protocole est réalisé correctement, ~ 6-12 × 10 ⁶ neutrophiles peuvent être récupérés à partir d'une souris non infectées et jusqu'à ~ 30-40 × 10 ⁶ neutrophiles peuvent être isolés à partir d&…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES	Cellgro	10-041-CV
Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)	GemCell	100500
Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)	GIBCO	15140
0.5 M EDTA	Quality Biological Inc	351-027-101
0.2% and 1.6% sodium chloride	JT Baker	3624	Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered
Sterile filtered Histopaque 1077	Sigma	10771	Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use
Sterile filtered Histopaque 1119	Sigma	11191	Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium	Cellgro	210-40-CV
Ethyl Alcohol (200 proof)	The Warner Graham Company	64-17-5
CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate)	Invitrogen	C-7025	Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine)	Invitrogen	C-2927	Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11)	eBioscience	170451-82
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)	BD Pharmingen	551461
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)	BD Pharmingen	560599
Anti-mouse CD11b (Clone M1/70)	eBioscience	47-0112-82
Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141	Use at 1:100 dilution
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Molecular Probes	L-23105	Use at 1:1000 dilution
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	67-68-5
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS	USB Corporation	19943
			Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils.
			Materials
C57BL/6 mice	Taconic
15 ml centrifuge tubes	Corning	430053
50 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352070
25 ml serological pipettes	Celltreat	229225B
10 ml serological pipettes	Celltreat	229210B
5 ml serological pipettes	Celltreat	229205B
Pasteur pipettes (3 ml)	BD Falcon	357575
12 ml syringes	Kendall monoject	512878
25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)	BD	305122
100 mm cell strainers	BD Falcon	352360
Bactericidal Petri dishes	BD Falcon	351029
Combitips Plus Biopur	Eppendorf	2249608-5
Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel)	Biomedical Research Instruments	10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000	Instruments sterilized prior to use
			Equipment
Tissue culture hood	The Baker Company	SG403
Refrigerated centrifuge	Thermo Fischer Scientific	75004521
37 °C shaking water bath	Thermo Fischer Scientific	3166721
			Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol.