Vi genetisk kode for den unaturlige aminosyre, p-azido-L-phenylalanin på forskellige målrettede positioner i GPCR'er og vise alsidigheden af azidogruppen i forskellige applikationer. Heriblandt en målrettet fototværbinding teknologi til at identificere rester i den ligandbindende lomme af en GPCR, og stedspecifik bioorthogonal modificering af GPCR'er med et peptid-epitop-mærke eller fluorescerende probe.
For at lette strukturelle og dynamiske studier af G-protein-koblet receptor (GPCR) signalering komplekser, er nye fremgangsmåder forpligtet til at indføre informative prober eller etiketter i udtrykte receptorer, der ikke forstyrrer receptorfunktion. Vi anvendte amber codon undertrykkelse teknologi til genetisk encode unaturlig aminosyre, p-azido-L-phenylalanin (AZF) ved forskellige målrettede positioner i GPCR'er heterologt udtrykt i pattedyrceller. Alsidigheden i azidogruppen er illustreret her i forskellige programmer for at studere GPCRs i deres oprindelige cellulære miljø eller under vaskemiddel opløste forhold. Først viser vi et cellebaseret målrettet fototværbinding teknologi til at identificere de rester i den ligandbindende lomme af GPCR hvor en tritium-mærket lille molekyle ligand tværbindes til en genetisk kodet azido aminosyre. Vi derefter demonstrere stedsspecifikke modifikation af GPCRs af bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligatur reaktiontion, der er målrettet azidogruppen hjælp phosphinligander derivater. Vi diskuterer en generel strategi for målrettet peptid-epitop tagging af udtrykte membranproteiner i-kulturen og dens påvisning under anvendelse af en helcelle-ELISA fremgangsmåde. Vi viser endelig, at AZF-GPCR'er kan selektivt mærkes med fluorescerende prober. De drøftede metoder er generelle, idet de i princippet kan anvendes på enhver aminosyre position i enhver udtrykte GPCR at afhøre aktive signalsystemer komplekser.
Heptahelical G-proteinkoblede receptorer (GPCR) omfatter en superfamilie af højdynamiske membranproteiner, der medierer vigtige og forskellige ekstracellulære signaler. I den klassiske paradigme, er receptor-aktivering kombineret med ligand-induceret konformationelle ændringer. 1 er 2 Nylige fremskridt i strukturel biologi GPCR'er billede betydelig indsigt i de molekylære mekanismer i transmembran-signalering. 3-5 imidlertid at forstå med større kemisk præcision funktionel mekanisme og strukturelle dynamik GPCR signalering, er en værktøjskasse af metoder der kræves for at inkorporere informative molekylære og kemiske prober til at afhøre aktive signalsystemer komplekser.
Til dette formål har vi tilpasset en metode til site-specifikt indføre ikke-eller minimalt forstyrrende sonder ind udtrykte receptorer baseret på unaturlig aminosyre (ULA) mutagenese hjælp amber codon undertrykkelse teknologi tidligere udviklet af Schultz og coworkers. 6. Vi optimeret ULA mutagenese metode til at opnå et højt afkast udtryk og mutagenesesystem for proteiner såsom GPCRs, som er vanskelige at udtrykke i andre end pattedyrceller mest heterologe systemer. Ved hjælp af en retvinklet manipuleret suppressor tRNA og udviklede aminoacyl-tRNA syntetase par for en specifik ULA, vi stedspecifikt introduceret UAAs i udtrykte target GPCRs. Den vellykkede inkorporering af UAAs, p-acetyl-L-phenylalanin (AcF), p-benzoyl-L-phenylalanin (BZF) og p-azido-L-phenylalanin (AZF) er blevet påvist i vores model GPCR'er – rhodopsin og human CC kemokinreceptor, CCR5. 7, 8
I princippet kan en ULA være genetisk kodet til enhver position inden for protein-sekvens, og denne egenskab er et uvurderligt biokemisk værktøj, da det giver mulighed for single-codon scanning af et mål GPCR. Vi fokuserer her specifikt på den alsidighed af ULA, AZF, som har en reaktiv azigøre del. Ud over at tjene som en unik infrarød (IR) probe, 8, 9 AZF kan også tjene som en fotoaktiverbar tværbinder ved omsætning med tilgrænsende primære aminer eller alifatiske hydrogenatomer. Derudover kan biologisk inert azidogruppen deltage som en selektiv kemisk håndtaget bioorthogonal mærkning reaktioner. Her præsenterer vi eksempler, der illustrerer de nyttige anvendelser af stedspecifik inkorporering af AZF i GPCRs, såsom målrettet fotokrydsbinding til at fælde en receptor-ligand-kompleks, og ændring af GPCRs ved bioorthogonal epitop tagging og fluorescerende mærkning af strategier.
Fotoaktiverbar reagenser er blevet brugt til at studere biologiske systemer siden 1960'erne. 10. I denne periode har en overflod af receptor-ligand tværbindingsprocesser eksperimenter blevet rapporteret til at studere GPCR komplekser, hvoraf de fleste er involveret brugen af photoaffinity ligander. 11, 12 Men disse programmer er teknisk begrænset, da de der krævere syntese af ligander, der bærer en tværbindingsgruppe. 13-15 Desuden med tværbindergruppe i liganden, det er udfordrende at identificere placeringen af crosslink på GPCR. Stedspecifikt indføre fototværbinding grupper som UAAs i proteiner ved hjælp af amber codon undertrykkelsesteknologi er et værdifuldt fremskridt. 16, 17 Vi udviklede en Fototværbindingen teknik til at identificere den bindende grænseflade på en receptor, som er involveret i dannelsen af en receptor-ligand-kompleks i levende celler ved at indføre fotolabile grupper på GPCR. 18, 19 Her beskriver vi forsøgsprotokollen og metode for dataanalyse for at anvende denne målrettede fotokrydsbinding teknologi til at identificere bindingssted af en lille-molekyle ligand tritieret maraviroc på CCR5. Denne metode udnytter den præcis kvantificering af den radioaktive håndtag på liganden, i over at fastholde den native kemiske struktur af liganden.
Fluorescens-baserede teknikker støtter præcis forståelse af det strukturelle grundlag af receptor-aktivering ved direkte sondering den konformationelle tilstand af receptoren. 20, 21 imidlertid teknikker besidder fleksibilitet til at indføre fluorescerende mærker i GPCR'er stedspecifikt er begrænsede. Vi er interesseret i at ansætte bioorthogonal kemisk modifikation strategier til at lette enkelt molekyle detektion (SMD) af GPCR signalering komplekser. 22. azidogruppen kan deltage i bioorthogonal kemier såsom Staudinger-Bertozzi ligatur, 23, 24 kobber-fri strain-fremmet azid- alkyn cycloaddition (SpAAC) 25 og kobber-katalyseret azid-alkyn cycloaddition (CuAAC). 26. Vi fokuserer her på Staudinger-Bertozzi ligeringsreaktion, der involverer den specifikke reaktion mellem en azid og en phosphin. Vi viser, at anvendelsen af to forskellige phosphinoxider derivater konjugeret til et peptid epitop (FLAG peptid) eller et fluorescerende mærke(Fluorescein) for at opnå stedspecifik modifikation af GPCRs.
Vi har tidligere optimeret betingelserne for site-specifik mærkning af rhodopsin AZF varianter ved hjælp af røntgen-krystalstruktur og dynamiske simuleringer til at vælge target sites, der er solvent udsat for. 27, 28 Vi illustrerede også muligheden for at opnå baggrunden-fri mærkning af Staudinger- Bertozzi ligering. 29. Vi viser her den generelle procedure anvendes til at opnå fluorescerende mærkning af en detergent-solubiliseret receptor, som er immobiliseret på en immunoaffinitets matrix og efterfølgende visualiseret ved i-gel-fluorescens. Derudover viser vi en nyttig udvidelse på denne mærkning strategi til at identificere holdninger gøres til genstand for mærkning på en receptor af ukendt struktur, CCR5. Dette udføres ved hjælp af en målrettet peptid-epitop tagging strategi, der bygger på bioorthogonal ændring af AZF-GPCR varianter i en celle-baserede semi-high throughput format. 30. Dennemetode udnytter flertrins afsløring egenskaber af et celleoverflade-ELISA for at overvåge mærkning begivenheder.
De metoder, vi diskuterer her, er generelle og kan i princippet anvendes på enhver GPCR indarbejdet med AZF hjælp af amber codon undertrykkelse teknologi. I de protokoller, der præsenteres her, vi detalje de skridt, der er involveret i pattedyrcelleekspression af receptorer indarbejdet med UAAs såsom AZF bruger den unaturlige aminosyre mutagenesefremgangsmåde og deres efterfølgende ansøgninger for at lette strukturelle og dynamiske studier af GPCRs.
Vi beskriver her en robust metode til stedspecifik inkorporering af en reaktiv sonde, AZF, i GPCRs og demonstrere tre nyttige anvendelser af dette værktøj til at studere struktur og dynamik GPCRs. Vores metode til site-specifikt inkorporere UAAs omgår et grundlæggende problem med en alternativ strategi baseret på kemisk mærkning 32, 33 eller fastgørelse photocrosslinkers 34 til en enkelt tilgængelig cystein mutant. Selv kemier, der er målrettet cystein thiolgrupper er blevet anvendt til at…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker generøse støtte fra en række fonde og filantropiske donorer (se SakmarLab.org).
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Plasmid pSVB. Yam | (Ye et al., 2008) | ||
Plasmid pcDNA.RS for azF | (Ye et al., 2009) | ||
Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5 | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position | ||
HEK 293T cells | Adherent cells | ||
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 10566 | |
Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14200 | |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
Lipofectamine Plus | Invitrogen | Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015 |
|
p-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | 6162 | |
Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials | |||
[header] | |||
Maxima ML-3500S UV-A lamp | Spectronics Corporation | azF is activated by 365-nm light | |
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14065 | |
HEPES | Irvine Scientific | 9319 | |
Bovine serum albumin | Roche | 3117405001 | |
Tritium-labeled ligand | From collaborator (Grunbeck et al., 2012) | ||
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166 | |
NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
Trans-Blot SD apparatus | Biorad | Apparatus for semi-dry transfer | |
Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Millipore | IPVH00010 | |
Non-fat powered milk | Fisher Scientific | NC9934262 | |
Tween-20 | Aldrich | 274348 | |
Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | Scintillation fluid |
Scintillation vials | Fisher Scientific | 333726 | |
LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter | Perkin Elmer | Beta-Scintillation counter | |
Anti-rhodopsin 1D4 mAb | National Cell Culture Center | custom | |
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG | KPL, Inc. | 474-1806 | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
Hyblot CL AR film | Denville | E3018 | |
Table 2. Targeted photocrosslinking materials | |||
[header] | |||
0.25% Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
FLAG-triarylphosphine | Sigma | GPHOS1 | |
M2 FLAG mAb | Sigma | F1804 | |
anti-CCR5 2D7 mAb | BD Biosciences | 555990 | |
Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
96-well plate | Costar | 3601 | Clear bottom, high binding EIA/RIA |
Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium) | Gibco | 14040 | |
16% Paraformaldehyde | EMS | 28908 | |
HRP-conjugated | KPL, Inc. | 474-1516 | |
anti-rabbit IgG | KPL, Inc. | 474-1516 | |
Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
Hydrogen peroxide | DE Healthcare Products | 97-93399 | |
CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader | Perseptive Biosystems | ||
Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials | |||
[header] | |||
Fluorescein-phosphine | (Huber et al., submitted 2012) | ||
Nonapeptide (C9 peptide) | AnaSpec | 62190 | Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH |
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner | GE Healthcare | discontinued | Scanner with 488-nm wavelength laser |
Table 4. Fluorescent labeling materials |