Molecular Probes génétiquement codés pour étude g récepteurs couplés à la protéine

Summary

Nous génétiquement coder l'acide aminé non naturel, p-azido-L-phénylalanine à divers postes ciblés dans les RCPG et de montrer la polyvalence du groupe azido dans différentes applications. Ceux-ci comprennent une technologie de photoréticulation ciblée pour identifier des résidus dans la poche de liaison au ligand d'un GPCR, et spécifique à un site de modification bioorthogonal GPCR avec un peptide marqueur d'épitope ou une sonde fluorescente.

Abstract

Pour faciliter les études structurales et dynamiques du G récepteur couplé à la protéine (GPCR) des complexes de signalisation, de nouvelles approches sont nécessaires pour introduire des sondes ou des étiquettes informatives en récepteurs exprimés qui ne perturbent pas la fonction du récepteur. Nous avons utilisé la technologie de suppression de codon ambre génétiquement coder l'acide aminé non naturel, p-azido-L-phénylalanine (AZF) à différents postes ciblés dans GPCR hétérologue exprimées dans les cellules de mammifères. La polyvalence du groupe azido est illustré ici dans différentes applications d'étudier RCPG dans leur environnement cellulaire natif ou sous détergents conditions solubilisées. Tout d'abord, nous démontrons une technologie à base de cellules photo-réticulation ciblée pour identifier les résidus dans la poche de liaison au ligand de GPCR où un ligand à petite molécule marquée au tritium est réticulé à un acide azido aminé génétiquement codé. Nous démontrons alors modification spécifique au site des RCPG par le bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligature réactionstion qui vise le groupe azido en utilisant des dérivés de phosphine. Nous discutons d'une stratégie générale pour l'étiquetage ciblé peptide épitope de protéines membranaires exprimées dans la culture et sa détection en utilisant une approche basée sur ELISA cellule entière. Enfin, nous montrons que AZF-GPCR peuvent être étiquetés de manière sélective avec des sondes fluorescentes. Les méthodes sont discutés général, en ce qu 'ils peuvent en principe être appliquée à n'importe quelle position d'acide aminé dans toute GPCR exprimé pour interroger les complexes de signalisation actives.

Introduction

Heptahélice G récepteurs couplés aux protéines (RCPG) comprennent une superfamille de protéines de la membrane hautement dynamiques qui assurent la médiation des signaux extracellulaires importantes et variées. Dans le paradigme classique, l'activation du récepteur est couplé à des changements de conformation induites par le ligand. ^{1, 2} Les récents progrès dans la biologie structurale des RCPG ont permis de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la signalisation transmembranaire. ^3-5 Cependant, pour comprendre avec plus de précision chimique du mécanisme fonctionnel et dynamique des structures de signalisation des RCPG, une boîte à outils d'approches sont nécessaires pour incorporer des sondes moléculaires et chimiques d'information pour interroger des complexes de signalisation actifs.

À cette fin, nous avons adapté une méthode de site spécifiquement introduire non ou minimalement sondes perturbateurs dans des récepteurs exprimés sur la base de contre nature acide aminé (SAU) de mutagenèse utilisant codon ambre technologie de suppression précédemment mis au point par Schultz et c. oworkers ⁶ Nous avons optimisé la méthode de mutagenèse SAU pour obtenir une expression à haut rendement et d'un système de mutagenèse pour les protéines telles que les GPCR, qui sont difficiles à exprimer dans des systèmes hétérologues plus que d'autres cellules de mammifères. L'utilisation d'un suppresseur orthogonal conçu ARNt et évolué aminoacyl-ARNt synthétase pour une SAU spécifique, nous place spécifiquement introduit SAU dans RCPG cibles exprimées. L'incorporation réussie de SAU, la p-acétyl-L-phénylalanine (ACF), p-benzoyl-L-phénylalanine (BZF), et le p-azido-L-phénylalanine (AZF) a été démontrée dans les RCPG modèle – rhodopsine humaine et le récepteur de la chimiokine CC, CCR5. ^{7, 8}

En principe, une SAU peut être génétiquement encodés à n'importe quelle position dans la séquence de la protéine et cette propriété est un outil biochimique inestimable, car elle permet de numériser un seul codon d'un GPCR cible. Nous nous concentrons ici spécifiquement sur la polyvalence de la SAU, AZF, qui a un azi réactivefaire partie. En plus de servir en tant que l'infrarouge (IR) sonde unique, ^{8, 9} AZF peut aussi servir comme un agent de réticulation photo-activable par réaction avec des amines primaires aliphatiques voisins ou des atomes d'hydrogène. En outre, le groupe azido biologiquement inerte peut participer en tant que poignée chimique sélective en réactions de marquage bioorthogonal. Ici, nous présentons des exemples illustrant les applications utiles de l'incorporation spécifique du site de l'usine AZF en GPCR, comme photoréticulation ciblées pour piéger un complexe récepteur-ligand, et la modification des RCPG par bioorthogonal marquage d'épitope et les stratégies de marquage fluorescent.

Des réactifs photo-activables ont été utilisées pour étudier les systèmes biologiques depuis les années 1960. ¹⁰ Durant cette période, une abondance d'expériences de reticulation récepteur-ligand ont été rapportés pour étudier des complexes de GPCR, dont la plupart impliquaient l'utilisation de ligands de photo-affinité ^{11, 12} Cependant, ceux-ci. applications sont techniquement limités, car ils Requirla synthèse de l'e de ligands portant un groupe de reticulation. ^13-15 En outre, avec le groupement réticulant dans le ligand, il est difficile d'identifier l'emplacement de la réticulation sur le GPCR. L'introduction du site-spécifique groupes photoréticulation que SAU en protéines en utilisant le codon ambre technologie de suppression est un progrès important. ^{16, 17} Nous avons développé une technique de photoréticulation pour identifier l'interface de fixation sur un récepteur qui est impliqué dans la formation d'un complexe récepteur-ligand dans cellules vivantes en introduisant des groupes photolabiles dans les RCPG. ^{18, 19} Nous décrivons ici le protocole expérimental et la méthode d'analyse des données pour l'application de cette technologie de photoréticulation ciblée pour identifier le site de liaison d'un ligand à petite molécule, le maraviroc tritiée, sur le CCR5. Ce procédé tire parti de la quantification précise de la poignée sur le ligand radioactif, en plus de conserver la structure chimique du ligand natif.

Des techniques basées sur la fluorescence en charge la compréhension précise de la base structurelle de l'activation du récepteur en sondant directement l'état conformationnel du récepteur. ^{20, 21} Cependant, les techniques qui possèdent la flexibilité d'introduire des marqueurs fluorescents dans les GPCR sont site spécifiquement limité. Nous sommes intéressés à utiliser des stratégies de modification chimique bioorthogonal pour faciliter la détection de molécule unique (SMD) de GPCR complexes de signalisation. ²² Le groupe azido peut participer à des chimies bioorthogonal tels que Staudinger-Bertozzi ligature, ^{23, 24} sans cuivre souche promu azoture cycloaddition alcyne (SpAAC) ²⁵ et de l'azoture-alcyne cycloaddition catalysée par le cuivre (CuAAC). ²⁶ Nous nous concentrons ici sur la réaction de ligature Staudinger-Bertozzi qui implique la réaction spécifique entre un azoture et une phosphine. Nous démontrons l'utilisation de deux dérivés de phosphine, les différents conjugués à un épitope de peptide (peptide FLAG) ou un marqueur fluorescent(Fluorescéine) afin de réaliser la modification spécifique d'un site de GPCR.

Nous avons déjà optimisé les conditions d'étiquetage spécifique du site de la rhodopsine variantes AZF en utilisant la structure cristalline aux rayons X et des simulations dynamiques de choisir des sites cibles qui sont exposés au solvant. ^{27, 28} Nous avons également illustré la faisabilité d'atteindre étiquetage sans fond par Staudinger- ligature Bertozzi. Nous démontrons ici ²⁹ le mode opératoire général utilisé pour réaliser le marquage fluorescent d'un récepteur de détergent solubilisé qui est immobilisé sur une matrice d'immuno-affinité et ensuite visualisés par fluorescence dans le gel. En outre, nous démontrons une extension utile à cette stratégie d'étiquetage pour identifier les positions se prêtant à l'étiquetage sur un récepteur de structure inconnue, CCR5. Ceci est réalisé en utilisant une stratégie de marquage peptide-épitope cible qui repose sur une modification de bioorthogonal AZF-GPCR variants dans un format semi-haut débit à base de cellules. Cette ³⁰méthode exploite les propriétés de détection multi-étapes d'un test ELISA de surface cellulaire pour surveiller les événements en matière d'étiquetage.

Les méthodes que nous discutons ici sont générales et peuvent en principe être appliquées à tout GPCR incorporé avec AZF utilisant le codon ambre technologie de suppression. Dans les protocoles présentés ici nous détaillons les étapes impliquées dans l'expression de cellules de mammifères avec des récepteurs intégrés SAU tels que AZF en utilisant le procédé de mutagenèse de l'acide aminé non naturel et leurs applications ultérieures pour faciliter les études structurales et dynamiques de GPCR.

Protocol

Une. Incorporation génétique spécifique de site d'acides aminés non naturels dans les RCPG Maintenir des cellules HEK293T dans du DMEM (4,5 g / L de glucose, de glutamine 2 mM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5%. Transfecter les cellules cultivées à 60-80% de confluence dans une plaque de 10 cm en utilisant le réactif Lipofectamine Plus. 750 ul de DMEM, ajouter 10 ul de réactif Plus, 3,5 ug d'ADNc de GP…

Representative Results

Nous avons employé la méthode de mutagenèse d'acide aminé non naturel spécifique de site pour introduire des sondes moléculaires dans un GPCR en utilisant le codon ambre technologie de suppression. Le schéma de la figure 1 présente les étapes marquantes de la méthodologie et les différentes applications de l'intégration de la SAU polyvalent, p-azido-L-phénylalanine (AZF), dans les RCPG. Expression de AZF-GPCR dans des cellules de mammifères permet photoréticulation ciblé…

Discussion

Nous décrivons ici une méthode robuste pour incorporation spécifique du site d'une sonde réactive, AZF, en RCPG et démontrons trois applications utiles de cet outil pour étudier la structure et la dynamique des RCPG. Notre méthode de site spécifiquement incorporer SAU contourne un problème fondamental d'une stratégie alternative basée sur l'étiquetage chimique ^{32, 33} ou ³⁴ photoréticulants fixer à un seul mutant cystéine accessible. Bien que, chimies qui ciblent des group…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid pSVB. Yam			(Ye et al., 2008)
Plasmid pcDNA.RS for azF			(Ye et al., 2009)
Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5			Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position
HEK 293T cells			Adherent cells
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Gibco	10566
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio-products	100-106
Lipofectamine Plus	Invitrogen	Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015
p-azido-L-phenylalanine	Chem-Impex International	6162
			Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials
			[header]
Maxima ML-3500S UV-A lamp	Spectronics Corporation		azF is activated by 365-nm light
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS)	Gibco	14065
HEPES	Irvine Scientific	9319
Bovine serum albumin	Roche	3117405001
Tritium-labeled ligand			From collaborator (Grunbeck et al., 2012)
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166
NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Trans-Blot SD apparatus	Biorad		Apparatus for semi-dry transfer
Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Millipore	IPVH00010
Non-fat powered milk	Fisher Scientific	NC9934262
Tween-20	Aldrich	274348
Ecoscint A	National Diagnostics	LS-273	Scintillation fluid
Scintillation vials	Fisher Scientific	333726
LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter	Perkin Elmer		Beta-Scintillation counter
Anti-rhodopsin 1D4 mAb	National Cell Culture Center	custom
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG	KPL, Inc.	474-1806
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34080
Hyblot CL AR film	Denville	E3018
			Table 2. Targeted photocrosslinking materials
			[header]
0.25% Trypsin	Invitrogen	15050065
FLAG-triarylphosphine	Sigma	GPHOS1
M2 FLAG mAb	Sigma	F1804
anti-CCR5 2D7 mAb	BD Biosciences	555990
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
96-well plate	Costar	3601	Clear bottom, high binding EIA/RIA
Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium)	Gibco	14040
16% Paraformaldehyde	EMS	28908
HRP-conjugated	KPL, Inc.	474-1516
anti-rabbit IgG	KPL, Inc.	474-1516
Amplex Red	Invitrogen	A12222
Hydrogen peroxide	DE Healthcare Products	97-93399
CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader	Perseptive Biosystems
			Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials
			[header]
Fluorescein-phosphine			(Huber et al., submitted 2012)
Nonapeptide (C9 peptide)	AnaSpec	62190	Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner	GE Healthcare	discontinued	Scanner with 488-nm wavelength laser
			Table 4. Fluorescent labeling materials