Genetisk kodede Molecular Probes at studere G-protein-koblede receptorer

Summary

Vi genetisk kode for den unaturlige aminosyre, p-azido-L-phenylalanin på forskellige målrettede positioner i GPCR'er og vise alsidigheden af ​​azidogruppen i forskellige applikationer. Heriblandt en målrettet fototværbinding teknologi til at identificere rester i den ligandbindende lomme af en GPCR, og stedspecifik bioorthogonal modificering af GPCR'er med et peptid-epitop-mærke eller fluorescerende probe.

Abstract

For at lette strukturelle og dynamiske studier af G-protein-koblet receptor (GPCR) signalering komplekser, er nye fremgangsmåder forpligtet til at indføre informative prober eller etiketter i udtrykte receptorer, der ikke forstyrrer receptorfunktion. Vi anvendte amber codon undertrykkelse teknologi til genetisk encode unaturlig aminosyre, p-azido-L-phenylalanin (AZF) ved forskellige målrettede positioner i GPCR'er heterologt udtrykt i pattedyrceller. Alsidigheden i azidogruppen er illustreret her i forskellige programmer for at studere GPCRs i deres oprindelige cellulære miljø eller under vaskemiddel opløste forhold. Først viser vi et cellebaseret målrettet fototværbinding teknologi til at identificere de rester i den ligandbindende lomme af GPCR hvor en tritium-mærket lille molekyle ligand tværbindes til en genetisk kodet azido aminosyre. Vi derefter demonstrere stedsspecifikke modifikation af GPCRs af bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligatur reaktiontion, der er målrettet azidogruppen hjælp phosphinligander derivater. Vi diskuterer en generel strategi for målrettet peptid-epitop tagging af udtrykte membranproteiner i-kulturen og dens påvisning under anvendelse af en helcelle-ELISA fremgangsmåde. Vi viser endelig, at AZF-GPCR'er kan selektivt mærkes med fluorescerende prober. De drøftede metoder er generelle, idet de i princippet kan anvendes på enhver aminosyre position i enhver udtrykte GPCR at afhøre aktive signalsystemer komplekser.

Introduction

Heptahelical G-proteinkoblede receptorer (GPCR) omfatter en superfamilie af højdynamiske membranproteiner, der medierer vigtige og forskellige ekstracellulære signaler. I den klassiske paradigme, er receptor-aktivering kombineret med ligand-induceret konformationelle ændringer. ^{1 er 2} Nylige fremskridt i strukturel biologi GPCR'er billede betydelig indsigt i de molekylære mekanismer i transmembran-signalering. ^3-5 imidlertid at forstå med større kemisk præcision funktionel mekanisme og strukturelle dynamik GPCR signalering, er en værktøjskasse af metoder der kræves for at inkorporere informative molekylære og kemiske prober til at afhøre aktive signalsystemer komplekser.

Til dette formål har vi tilpasset en metode til site-specifikt indføre ikke-eller minimalt forstyrrende sonder ind udtrykte receptorer baseret på unaturlig aminosyre (ULA) mutagenese hjælp amber codon undertrykkelse teknologi tidligere udviklet af Schultz og coworkers. ^6. Vi optimeret ULA mutagenese metode til at opnå et højt afkast udtryk og mutagenesesystem for proteiner såsom GPCRs, som er vanskelige at udtrykke i andre end pattedyrceller mest heterologe systemer. Ved hjælp af en retvinklet manipuleret suppressor tRNA og udviklede aminoacyl-tRNA syntetase par for en specifik ULA, vi stedspecifikt introduceret UAAs i udtrykte target GPCRs. Den vellykkede inkorporering af UAAs, p-acetyl-L-phenylalanin (AcF), p-benzoyl-L-phenylalanin (BZF) og p-azido-L-phenylalanin (AZF) er blevet påvist i vores model GPCR'er – rhodopsin og human CC kemokinreceptor, CCR5. ^{7, 8}

I princippet kan en ULA være genetisk kodet til enhver position inden for protein-sekvens, og denne egenskab er et uvurderligt biokemisk værktøj, da det giver mulighed for single-codon scanning af et mål GPCR. Vi fokuserer her specifikt på den alsidighed af ULA, AZF, som har en reaktiv azigøre del. Ud over at tjene som en unik infrarød (IR) ^{probe, 8, 9} AZF kan også tjene som en fotoaktiverbar tværbinder ved omsætning med tilgrænsende primære aminer eller alifatiske hydrogenatomer. Derudover kan biologisk inert azidogruppen deltage som en selektiv kemisk håndtaget bioorthogonal mærkning reaktioner. Her præsenterer vi eksempler, der illustrerer de nyttige anvendelser af stedspecifik inkorporering af AZF i GPCRs, såsom målrettet fotokrydsbinding til at fælde en receptor-ligand-kompleks, og ændring af GPCRs ved bioorthogonal epitop tagging og fluorescerende mærkning af strategier.

Fotoaktiverbar reagenser er blevet brugt til at studere biologiske systemer siden 1960'erne. ^10. I denne periode har en overflod af receptor-ligand tværbindingsprocesser eksperimenter blevet rapporteret til at studere GPCR komplekser, hvoraf de fleste er involveret brugen af photoaffinity ligander. ^{11, 12} Men disse programmer er teknisk begrænset, da de der krævere syntese af ligander, der bærer en tværbindingsgruppe. ^13-15 Desuden med tværbindergruppe i liganden, det er udfordrende at identificere placeringen af crosslink på GPCR. Stedspecifikt indføre fototværbinding grupper som UAAs i proteiner ved hjælp af amber codon undertrykkelsesteknologi er et værdifuldt fremskridt. ^{16, 17} Vi udviklede en Fototværbindingen teknik til at identificere den bindende grænseflade på en receptor, som er involveret i dannelsen af en receptor-ligand-kompleks i levende celler ved at indføre fotolabile grupper på GPCR. ^{18, 19} Her beskriver vi forsøgsprotokollen og metode for dataanalyse for at anvende denne målrettede fotokrydsbinding teknologi til at identificere bindingssted af en lille-molekyle ligand tritieret maraviroc på CCR5. Denne metode udnytter den præcis kvantificering af den radioaktive håndtag på liganden, i over at fastholde den native kemiske struktur af liganden.

Fluorescens-baserede teknikker støtter præcis forståelse af det strukturelle grundlag af receptor-aktivering ved direkte sondering den konformationelle tilstand af receptoren. ^{20, 21} imidlertid teknikker besidder fleksibilitet til at indføre fluorescerende mærker i GPCR'er stedspecifikt er begrænsede. Vi er interesseret i at ansætte bioorthogonal kemisk modifikation strategier til at lette enkelt molekyle detektion (SMD) af GPCR signalering komplekser. ^22. azidogruppen kan deltage i bioorthogonal kemier såsom Staudinger-Bertozzi ^{ligatur, 23, 24} kobber-fri strain-fremmet azid- alkyn cycloaddition (SpAAC) ²⁵ og kobber-katalyseret azid-alkyn cycloaddition (CuAAC). ^26. Vi fokuserer her på Staudinger-Bertozzi ligeringsreaktion, der involverer den specifikke reaktion mellem en azid og en phosphin. Vi viser, at anvendelsen af ​​to forskellige phosphinoxider derivater konjugeret til et peptid epitop (FLAG peptid) eller et fluorescerende mærke(Fluorescein) for at opnå stedspecifik modifikation af GPCRs.

Vi har tidligere optimeret betingelserne for site-specifik mærkning af rhodopsin AZF varianter ved hjælp af røntgen-krystalstruktur og dynamiske simuleringer til at vælge target sites, der er solvent udsat for. ^{27, 28} Vi illustrerede også muligheden for at opnå baggrunden-fri mærkning af Staudinger- Bertozzi ligering. ^29. Vi viser her den generelle procedure anvendes til at opnå fluorescerende mærkning af en detergent-solubiliseret receptor, som er immobiliseret på en immunoaffinitets matrix og efterfølgende visualiseret ved i-gel-fluorescens. Derudover viser vi en nyttig udvidelse på denne mærkning strategi til at identificere holdninger gøres til genstand for mærkning på en receptor af ukendt struktur, CCR5. Dette udføres ved hjælp af en målrettet peptid-epitop tagging strategi, der bygger på bioorthogonal ændring af AZF-GPCR varianter i en celle-baserede semi-high throughput format. ^30. Dennemetode udnytter flertrins afsløring egenskaber af et celleoverflade-ELISA for at overvåge mærkning begivenheder.

De metoder, vi diskuterer her, er generelle og kan i princippet anvendes på enhver GPCR indarbejdet med AZF hjælp af amber codon undertrykkelse teknologi. I de protokoller, der præsenteres her, vi detalje de skridt, der er involveret i pattedyrcelleekspression af receptorer indarbejdet med UAAs såsom AZF bruger den unaturlige aminosyre mutagenesefremgangsmåde og deres efterfølgende ansøgninger for at lette strukturelle og dynamiske studier af GPCRs.

Protocol

1.. Stedsspecifik Genetisk Indarbejdelse af naturlige aminosyrer i GPCRs Oprethold HEK293T celler i DMEM (4,5 g / L glucose, 2 mM glutamin) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en 5% CO2-atmosfære. Transficere celler dyrket til 60-80% konfluens i en 10 cm plade ved hjælp af Lipofectamine Plus reagens. Til 750 ul DMEM, tilsættes 10 pi Plus reagens, 3,5 ug GPCR cDNA (pMT4. Rho eller pcDNA 3.1. CCR5) indeholdende amber-stopkodon i en ønsket position, 3,5 ug…

Representative Results

Vi ansat den unaturlige aminosyre mutagenese metode til site-specifikt indføre molekylære prober i en GPCR hjælp af amber codon undertrykkelse teknologi. Ordningen i figur 1 vises de vigtigste trin i den metode og de ​​forskellige anvendelser af at indarbejde den alsidige UAA, p-azido-L-phenylalanin (AZF), i GPCRs. Angivelse af AZF-GPCRs i pattedyrceller muliggør målrettet fototværbinding til ligander, og målrettet peptid-epitop tagging eller fluorescerende modifikationer af en GPCR …

Discussion

Vi beskriver her en robust metode til stedspecifik inkorporering af en reaktiv sonde, AZF, i GPCRs og demonstrere tre nyttige anvendelser af dette værktøj til at studere struktur og dynamik GPCRs. Vores metode til site-specifikt inkorporere UAAs omgår et grundlæggende problem med en alternativ strategi baseret på kemisk mærkning ^{32, 33} eller fastgørelse photocrosslinkers ³⁴ til en enkelt tilgængelig cystein mutant. Selv kemier, der er målrettet cystein thiolgrupper er blevet anvendt til at…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid pSVB. Yam			(Ye et al., 2008)
Plasmid pcDNA.RS for azF			(Ye et al., 2009)
Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5			Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position
HEK 293T cells			Adherent cells
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Gibco	10566
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio-products	100-106
Lipofectamine Plus	Invitrogen	Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015
p-azido-L-phenylalanine	Chem-Impex International	6162
			Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials
			[header]
Maxima ML-3500S UV-A lamp	Spectronics Corporation		azF is activated by 365-nm light
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS)	Gibco	14065
HEPES	Irvine Scientific	9319
Bovine serum albumin	Roche	3117405001
Tritium-labeled ligand			From collaborator (Grunbeck et al., 2012)
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166
NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Trans-Blot SD apparatus	Biorad		Apparatus for semi-dry transfer
Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Millipore	IPVH00010
Non-fat powered milk	Fisher Scientific	NC9934262
Tween-20	Aldrich	274348
Ecoscint A	National Diagnostics	LS-273	Scintillation fluid
Scintillation vials	Fisher Scientific	333726
LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter	Perkin Elmer		Beta-Scintillation counter
Anti-rhodopsin 1D4 mAb	National Cell Culture Center	custom
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG	KPL, Inc.	474-1806
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34080
Hyblot CL AR film	Denville	E3018
			Table 2. Targeted photocrosslinking materials
			[header]
0.25% Trypsin	Invitrogen	15050065
FLAG-triarylphosphine	Sigma	GPHOS1
M2 FLAG mAb	Sigma	F1804
anti-CCR5 2D7 mAb	BD Biosciences	555990
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
96-well plate	Costar	3601	Clear bottom, high binding EIA/RIA
Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium)	Gibco	14040
16% Paraformaldehyde	EMS	28908
HRP-conjugated	KPL, Inc.	474-1516
anti-rabbit IgG	KPL, Inc.	474-1516
Amplex Red	Invitrogen	A12222
Hydrogen peroxide	DE Healthcare Products	97-93399
CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader	Perseptive Biosystems
			Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials
			[header]
Fluorescein-phosphine			(Huber et al., submitted 2012)
Nonapeptide (C9 peptide)	AnaSpec	62190	Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner	GE Healthcare	discontinued	Scanner with 488-nm wavelength laser
			Table 4. Fluorescent labeling materials