Genetisch kodierte Molecular Probes, um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren Studieren

Summary

Wir genetisch kodieren die unnatürliche Aminosäure, p-Azido-L-Phenylalanin in verschiedenen gezielten Positionen in GPCRs und zeigen die Vielseitigkeit der Azidogruppe in verschiedenen Anwendungen. Dazu gehören eine gezielte Photo Technologie, um Rückstände in der Ligandenbindungstasche eines GPCR identifizieren und ortsspezifische Modifikation von GPCRs bioorthogonale mit einem Peptid-Epitop-Tag oder fluoreszierende Sonde.

Abstract

Um strukturelle und dynamische Untersuchungen von G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-Signalkomplexe zu erleichtern, sind neue Ansätze erforderlich, um informative Sonden oder Etiketten in exprimierten Rezeptoren, die Rezeptor-Funktion nicht stören, nicht vorstellen. Wir verwendeten Amber-Codon Unterdrückungstechnologie genetisch codieren die unnatürlichen Aminosäure-, p-Azido-L-phenylalanin (AZF) an verschiedenen Positionen in gezielter GPCRs heterolog in Säugerzellen exprimiert. Die Vielseitigkeit der Azidogruppe ist hier in verschiedenen Anwendungen dargestellt, dass GPCRs in ihrer Mutterzellumgebung oder unter Reinigungsmittel gelösten Bedingungen zu studieren. Zuerst zeigen wir eine zellbasierte Zielphototechnik, um die Rückstände in den Liganden-Bindungstasche von GPCR wo ein Tritium-markierten niedermolekularen Liganden mit einem genetisch codierte Aminosäure Azido vernetzt identifizieren. Wir haben dann zeigen, ortsspezifische Modifikation von GPCRs durch die bioorthogonale Staudinger-Ligation Bertozzi Reaktionention, die die Azidogruppe zielt mit Phosphin-Derivate. Wir diskutieren eine allgemeine Strategie zur gezielten Peptid-Epitop-Tagging von exprimierten Membranproteinen in-Kultur und ihrer Erkennung mit Hilfe eines Ganzzell-ELISA-basierten Ansatz. Schließlich zeigen wir, dass AZF-GPCRs selektiv mit fluoreszierenden Sonden markiert werden. Die diskutierten Methoden sind die allgemeinen, in dass sie sich grundsätzlich an jede Aminosäureposition in jedem angewendet werden, ausgedrückt GPCR aktive Signalkomplexe zu verhören.

Introduction

Heptahelikalen G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) eine Superfamilie von hochdynamischen Membranproteine, die wichtige und vielfältige extrazelluläre Signale zu vermitteln. In der klassischen Paradigma wird Rezeptor-Aktivierung mit Liganden-induzierter Konformationsänderungen gekoppelt. ^{1, 2} Jüngste Fortschritte in der Strukturbiologie von GPCRs haben bedeutende Einblicke in die molekularen Mechanismen der Transmembran-Signalisierung zur Verfügung gestellt. ^3-5 jedoch mit größerer Präzision der chemischen verstehen Funktionsmechanismus und Strukturdynamik von GPCR-Signalisierung wird ein Toolkit Ansätze erforderlich, um informative molekulare und chemische Sonden enthalten, um aktive Signalkomplexe zu verhören.

Zu diesem Zweck angepasst wir eine Methode, um ortsspezifisch einzuführen nicht oder minimal störenden Sonden in exprimierten Rezeptoren basierend auf unnatürliche Aminosäure (LF) Mutagenese mit Amber-Codon Unterdrückung Technologie zuvor von Schultz und c Pionieroworkers. ⁶ Wir optimierten die UAA-Mutagenese-Methode, um eine High-Yield-Expression und Mutagenese-System für Proteine, wie zB GPCRs, die nur schwer in anderen als den meisten Säugetierzellen heterologen Systemen zum Ausdruck zu erzielen. Mit einem orthogonalen entwickelt Suppressor-tRNA und entwickelte sich Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Paar für eine bestimmte UAA, wir ortsspezifisch eingeführt UAAs ausgedrückt Ziel GPCRs. Der erfolgreiche Einbau UAAs, p-Acetyl-L-Phenylalanin (ACF), p-Benzoyl-L-phenylalanin (BzF) und p-Azido-L-phenylalanin (AZF) wurde in unserem Modell GPCRs nachgewiesen – Rhodopsin und Menschen CC-Chemokin-Rezeptor CCR5. ^{7, 8}

Im Prinzip kann ein UAA genetisch an beliebigen Stellen innerhalb der Proteinsequenz codiert werden, und diese Eigenschaft ist ein unschätzbares Werkzeug, wie es biochemische ermöglicht Single-Codon Abtastung eines Ziel GPCR. Wir konzentrieren uns hier speziell auf die Vielseitigkeit der UAA, AZF, die eine reaktive azi hatEinheit zu tun. Zusätzlich zur Funktion als eine einzigartige Infrarot ^{(IR)-Sonde, 8, 9} AZF kann auch als photoaktivierbare Vernetzer dienen, indem sie mit benachbarten primären Aminen oder aliphatische Wasserstoffe dienen. Zusätzlich kann das biologisch inert Azidogruppe als selektive chemische Griff in bioorthogonalen Markierungsreaktionen teilnehmen. Hier präsentieren wir Ihnen Beispiele, die die nützlichen Anwendungen von ortsspezifischen Einbau von AZF in GPCRs, wie gezielte Photofalle zu einem Rezeptor-Liganden-Komplex, und Modifikation von GPCRs durch bioorthogonale Epitop-Tagging und Fluoreszenzmarkierungsstrategien.

Photoaktivierbare Reagenzien sind verwendet worden, um biologische Systeme untersuchen seit den 1960er Jahren. ¹⁰ In diesem Zeitraum sind eine Fülle von Rezeptor-Ligand-Vernetzungsexperimente wurde berichtet, GPCR-Komplexe zu untersuchen, von denen die meisten bei dem durch Verwendung von Photoaffinitätsliganden. ^{11, 12} jedoch, diese Anwendungen sind technisch begrenzt, da sie requirE Synthese von Liganden mit einer Vernetzungsgruppe. ^13-15 Zudem mit dem Vernetzer-Einheit in dem Liganden, es ist eine Herausforderung, die Position der auf der Querverbindung GPCR identifiziert. Ortsspezifisch Einführen Photogruppen UAAs in Proteine ​​unter Verwendung der Amber-Codon Unterdrückungstechnik ist ein wertvoller Fortschritt. ^{16, 17.} Wir entwickelten eine Phototechnik, um die Bindungsschnittstelle an einen Rezeptor, der in der Bildung eines Rezeptor-Ligand-Komplex beteiligt ist, zu identifizieren lebende Zellen durch die Einführung von photolabilen Gruppen in GPCRs. ^{18, 19} Hier beschreiben wir die Versuchsprotokoll und Methode der Datenanalyse für die Anwendung dieses gezielte Photo Technologie, um die Bindungsstelle eines niedermolekularen Liganden, tritiiertes Maraviroc, auf CCR5 identifizieren. Dieses Verfahren nutzt die genaue Quantifizierung der radioaktiven Griff auf dem Liganden, die neben Beibehaltung der nativen chemischen Struktur des Liganden.

Fluoreszenz-basierte Techniken unterstützen die präzise Kenntnis der strukturellen Basis der Rezeptor-Aktivierung durch direkte Erforschung der Konformation des Rezeptors. ^{20, 21} jedoch ortsspezifisch sind Techniken, die über die Flexibilität, um Fluoreszenzmarkierungen in GPCRs vorstellen begrenzt. Wir interessieren uns für den Einsatz bioorthogonale chemische Modifikation von Strategien zur Einzelmoleküldetektion (SMD) der GPCR-Signalkomplexe zu erleichtern. ^22. Die Azidogruppe in bioorthogonale Chemikalien wie Staudinger-Ligation ^{Bertozzi, 23, 24} kupferfreien Stamm-Azid-Teilnahme Alkin-Cycloaddition (SPAAC) ²⁵ und Kupfer-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) ²⁶ Wir konzentrieren. hier auf der Staudinger-Bertozzi Ligationsreaktion, die die spezifische Reaktion zwischen einem Azid und einem Phosphin beinhaltet. Wir zeigen die Verwendung zweier unterschiedlicher Phosphin-Derivate, ein Peptid-Epitop (FLAG-Peptid) oder einer fluoreszierenden Markierung konjugiert(Fluorescein), um ortsspezifische Modifikation von GPCRs zu erreichen.

Wir haben bereits optimiert die Bedingungen für die ortsspezifische Markierung von Rhodopsin AZF-Varianten mit Hilfe der Röntgenkristallstruktur und dynamische Simulationen, um Zielstellen, die Lösungsmittel ausgesetzt sind, zu wählen. ^{27, 28} Wir veranschaulicht auch die Möglichkeit, Hintergrundfreie Kennzeichnung zu erreichen durch Staudinger- Bertozzi Ligation. ^29. Wir zeigen hier eingesetzt, um die Fluoreszenzmarkierung von einem Reinigungsmittel mit gelöstem Rezeptor, der auf einer Immun Matrix immobilisiert wird und anschließend durch in-Gel-Fluoreszenz sichtbar zu erzielen allgemeine Verfahren. Außerdem zeigen wir eine sinnvolle Erweiterung auf dieser Kennzeichnungsstrategie zu Positionen zugänglich Kennzeichnung auf einem Rezeptor unbekannter Struktur, CCR5 identifizieren. Dies wird unter Verwendung einer Zielpeptid-Epitop-Tagging-Strategie, die auf bioorthogonalen Modifikation AZF-GPCR-Varianten in einem zellbasierten semiHochDurchSatzFormat durchgeführt stützt. ³⁰ DieserVerfahren nutzt die mehrstufige Detektionseigenschaften eines Zelloberflächen-ELISA zur Kennzeichnung Ereignisse überwachen.

Die Methoden wir hier diskutieren, sind die allgemeinen und im Prinzip kann auf jeden GPCR mit AZF mit der Amber-Codon Unterdrückung Technologie integriert angewendet werden. In den Protokollen hier präsentierten wir detailliert die Schritte in Säugerzell Expression von Rezeptoren mit UAAs wie AZF mit der unnatürlichen Aminosäure-Mutagenese-Methode und ihre Folgeanträge auf strukturelle und dynamische Studien von GPCRs erleichtern eingebaut beteiligt.

Protocol

1. Standortspezifische Genetische Einbau von unnatürlichen Aminosäuren in GPCRs Aufrechterhaltung HEK293T-Zellen in DMEM (4,5 g / l Glucose, 2 mM Glutamin), das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt war, bei 37 ° C in einem 5% CO 2-Atmosphäre. Transfektion die Zellen 60-80% Konfluenz in einem 10-cm-Platte mit Lipofectamine Plus-Reagenz gewachsen. 750 ul DMEM, mit 10 ul Plus-Reagens, 3,5 ug GPCR-cDNA (pMT4. Rho oder pcDNA 3.1. CCR5), der das Amber-Stopcodon an einer gew?…

Representative Results

Wir beschäftigten die unnatürliche Aminosäure Mutagenese Methode zur ortsspezifisch molekulare Sonden einzuführen in ein GPCR mit der Amber-Codon Unterdrückung Technologie. Das Schema in Abbildung 1 skizziert die wesentlichen Schritte der Methodik und die verschiedenen Anwendungen der Einbeziehung der vielseitige UAA, p-Azido-L-Phenylalanin (AZF) in GPCRs. Die Expression von AZF-GPCRs in Säugerzellen ermöglicht eine gezielte Photoliganden und gezielte Peptid-Epitop-Tagging oder fluoreszi…

Discussion

Wir beschreiben hier eine robuste Methode zur ortsspezifischen Einbau eines reaktiven Sonde, AZF, in GPCRs und zeigen drei nützliche Anwendungen dieses Werkzeug, um die Struktur und Dynamik von GPCRs zu studieren. Unsere Methode zur ortsspezifisch integrieren UAAs umgeht ein grundsätzliches Problem mit einer alternativen Strategie, die auf chemisch Beschriftung ^{32, 33} oder Anbringen Photovernetzer ³⁴ zu einem einzigen zugänglichen Cystein-Mutante. Obwohl die chemischen Cysteinthiolgruppen Ziel v…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid pSVB. Yam			(Ye et al., 2008)
Plasmid pcDNA.RS for azF			(Ye et al., 2009)
Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5			Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position
HEK 293T cells			Adherent cells
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Gibco	10566
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio-products	100-106
Lipofectamine Plus	Invitrogen	Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015
p-azido-L-phenylalanine	Chem-Impex International	6162
			Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials
			[header]
Maxima ML-3500S UV-A lamp	Spectronics Corporation		azF is activated by 365-nm light
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS)	Gibco	14065
HEPES	Irvine Scientific	9319
Bovine serum albumin	Roche	3117405001
Tritium-labeled ligand			From collaborator (Grunbeck et al., 2012)
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166
NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Trans-Blot SD apparatus	Biorad		Apparatus for semi-dry transfer
Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Millipore	IPVH00010
Non-fat powered milk	Fisher Scientific	NC9934262
Tween-20	Aldrich	274348
Ecoscint A	National Diagnostics	LS-273	Scintillation fluid
Scintillation vials	Fisher Scientific	333726
LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter	Perkin Elmer		Beta-Scintillation counter
Anti-rhodopsin 1D4 mAb	National Cell Culture Center	custom
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG	KPL, Inc.	474-1806
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34080
Hyblot CL AR film	Denville	E3018
			Table 2. Targeted photocrosslinking materials
			[header]
0.25% Trypsin	Invitrogen	15050065
FLAG-triarylphosphine	Sigma	GPHOS1
M2 FLAG mAb	Sigma	F1804
anti-CCR5 2D7 mAb	BD Biosciences	555990
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
96-well plate	Costar	3601	Clear bottom, high binding EIA/RIA
Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium)	Gibco	14040
16% Paraformaldehyde	EMS	28908
HRP-conjugated	KPL, Inc.	474-1516
anti-rabbit IgG	KPL, Inc.	474-1516
Amplex Red	Invitrogen	A12222
Hydrogen peroxide	DE Healthcare Products	97-93399
CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader	Perseptive Biosystems
			Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials
			[header]
Fluorescein-phosphine			(Huber et al., submitted 2012)
Nonapeptide (C9 peptide)	AnaSpec	62190	Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner	GE Healthcare	discontinued	Scanner with 488-nm wavelength laser
			Table 4. Fluorescent labeling materials