Genetisk kodet Molekylær Sonder til Study G protein-koblede reseptorer

Summary

Vi genetisk kode unaturlig aminosyre-, p-azido-L-fenylalanin ved forskjellige målrettede stillinger i GPCR og viser allsidigheten av azidogruppen i forskjellige anvendelser. Disse omfatter en målrettet photocrosslinking teknologi for å identifisere rester i det ligand-bindende lomme av et GPCR, og spesifikke bioorthogonal modifikasjon av GPCR med en peptid-epitop tag eller fluoriserende probe.

Abstract

For å legge til rette for strukturelle og dynamiske studier av G protein-koblet reseptor (GPCR) signal komplekser, er nye tilnærminger pålagt å innføre informative prober eller etiketter i uttrykt reseptorer som ikke forurolige reseptor funksjon. Vi brukte amber kodon undertrykkelse teknologi for å genetisk kode unaturlig aminosyre-, p-azido-L-fenylalanin (AZF) ved forskjellige målrettede stillinger i GPCR, heterologt uttrykt i pattedyrceller. Allsidigheten av azidogruppe er illustrert her i forskjellige applikasjoner for å studere GPCRs på sitt eget mobile miljøet eller under vaskemiddel oppløseliggjorte forhold. Først, viser vi et cellebasert rettet photocrosslinking teknologi for å identifisere rester i ligand-bindende lomme av GPCR hvor en tritium-merket små-molekyl ligand fornettes til en genetisk kodet aminosyre azido. Vi deretter demonstrere stedsspesifikk modifisering av GPCR av bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaksjonsjon som er rettet mot azidogruppe hjelp fosfin derivater. Vi diskuterer en generell strategi for målrettet peptid-epitop merking av uttrykte membran proteiner i-kulturen og dens påvisning ved hjelp av en hel-celle-baserte ELISA tilnærming. Til slutt viser vi at AZF-GPCRs kan selektivt merket med fluorescerende prober. De metoder som er diskutert er generelle ved at de i prinsippet kan anvendes på en hvilken som helst aminosyre posisjon i en hvilken som helst uttrykt GPCR for å avhøre aktive signaliseringskomplekser.

Introduction

Heptahelical G protein-koblede reseptorer (GPCR) omfatter en superfamily av svært dynamiske membran proteiner som formidler viktige og varierte ekstracellulære signaler. I den klassiske paradigme, er reseptoraktivering kombinert med ligand-indusert konformasjonsendringer. ^1, har ² Nyere fremskritt i strukturell biologi GPCRs gitt betydelig innsikt i de molekylære mekanismene for transmembrane signalering. ^3-5 Men for å forstå med større kjemisk nøyaktighet funksjonell mekanisme og strukturelle dynamikken i GPCR signalering, er en verktøykasse av metoder som kreves for å innlemme informative molekylære og kjemiske prober å avhøre aktive signalkomplekser.

Til dette formål har vi tilpasset en metode for å site-spesifikt innføre non-eller minimalt perturbasjonsinnretningen sonder inn uttrykt reseptorer basert på unaturlig aminosyre (UAA) mutagenese ved hjelp av rav kodonet undertrykkelse teknologi tidligere utviklet av Schultz og coworkers. ^6. Vi optimalisert UAA mutagenese metode for å oppnå et høyt utbytte ekspresjon og mutagenese-systemet for proteiner som GPCR, som er vanskelig å uttrykke i de heterologe systemer andre enn pattedyrceller. Ved hjelp av en rettvinklet konstruert suppressor tRNA og utviklet seg aminoacyl-tRNA syntetase pair for en bestemt UAA, vi site-spesifikt innført UAAS i uttrykt mål GPCRs. En vellykket inkorporering av UAAS, p-acetyl-L-fenylalanin (ACF), p-benzoyl-L-fenylalanin (BzF), og p-azido-L-fenylalanin (AZF) har blitt vist i vår modell GPCR – rhodopsin og human CC kjemokinreseptor, CCR5. ^{7, 8}

I prinsippet kan en UAA være genetisk kodet til enhver posisjon innen protein sekvens og denne egenskapen er et uvurderlig biokjemiske verktøy som gjør det mulig single-kodon skanning av et mål GPCR. Vi fokuserer her spesielt på allsidighet av UAA, AZF, som har en reaktiv azigjøre resten. I tillegg til å tjene som et infrarødt lys ^{(IR)-proben, 8, 9} AZF kan også tjene som en photoactivatable tverrbinder ved omsetning med nabo primære aminer eller alifatiske hydrogener. I tillegg kan den biologisk inert azidogruppen delta som en selektiv kjemisk håndtaket bioorthogonal merkingsreaksjoner. Her presenterer vi eksempler som illustrerer de nyttige anvendelser av stedsspesifikke inkorporering av AZF inn GPCRs, for eksempel målrettet photocrosslinking å felle en reseptor-ligand kompleks, og modifisering av GPCRs etter bioorthogonal epitop tagging og fluorescerende merking strategier.

Photoactivatable reagenser er blitt brukt til å studere biologiske systemer siden 1960-tallet. ^10. I denne periode har en overflod av reseptor-ligand-tverrbindingseksperimenter rapportert å studere GPCR komplekser, hvorav de fleste er involvert ved bruk av photoaffinity ligander. ^{11, 12} er imidlertid disse applikasjoner er teknisk begrenset, da de require syntese av ligander som bærer et tverrbindingsgruppen. ^13-15 Dessuten, med den tverrbinder resten i liganden, er det vanskelig å identifisere plasseringen av tverrbinding på GPCR. Site-spesifikt innføre photocrosslinking grupper som UAAS til proteiner ved hjelp av amber kodon undertrykkelse teknologi er et verdifullt fremskritt. ^{16. 17} Vi har utviklet en photocrosslinking teknikk for å identifisere bindingssystem på en reseptor som er involvert i dannelsen av et reseptor-ligand-kompleks i levende celler ved å innføre photolabile grupper i GPCR. ^{18., 19.} Her beskriver vi den eksperimentelle protokoll og fremgangsmåte for dataanalyse for å anvende denne målrettede photocrosslinking teknologi for å identifisere bindingssetet for en små-molekyl ligand, tritiert maraviroc, på CCR5. Denne metoden drar nytte av den nøyaktig kvantifisering av det radioaktive håndtaket på ligand, i tillegg til å beholde den opprinnelige kjemiske struktur av liganden.

Fluorescens-baserte teknikker støtter entydig forståelse av den strukturelle basis for reseptoraktivering ved direkte sondering konformasjonsendring tilstand av reseptoren. ^{20. 21} Imidlertid innehar teknikkene fleksibilitet til å innføre fluorescerende merkelapper til GPCR sete-spesifikt begrenset. Vi er interessert i å ansette bioorthogonal kjemisk modifikasjon strategier for å legge til rette for single-molekyl deteksjon (SMD) av GPCR signal komplekser. ²² azidogruppen kan delta i bioorthogonal kjemi som Staudinger-Bertozzi ligation, ^{23, 24} kobber-free belastning-forfremmet azid- alkynet cycloaddition (SpAAC) ²⁵ og kobber-katalysert azid-alkynet cycloaddition (CuAAC). ^26. Vi fokuserer her på Staudinger-Bertozzi ligeringsreaksjon som involverer den spesifikke reaksjon mellom et azid og et fosfin. Vi viser bruken av to forskjellige fosfin-derivater, konjugert til et peptid-epitop (FLAG-peptid) eller en fluorescerende markør(Fluorescein) for å oppnå setespesifikke modifikasjon av GPCR.

Vi har tidligere optimalisert vilkårene for stedsspesifikke merking av rhodopsin AZF varianter å bruke X-ray krystallstruktur og dynamiske simuleringer for å velge målområder som er løsemiddel eksponert. ^{27, 28} Vi har også illustrert muligheten til å oppnå bakgrunn fritt merking av Staudinger- Bertozzi ligering. ^29. Vi viser her den generelle fremgangsmåte anvendt for å oppnå fluorescerende merking av en detergent-solubilisert reseptor som er immobilisert på en immunoaffinitets matrise og deretter visualisert ved in-gel fluorescens. I tillegg viser vi en nyttig utvidelse på denne merking strategi for å identifisere stillinger mottagelig for merking på en reseptor med ukjent struktur, CCR5. Dette utføres ved hjelp av en målrettet peptid-epitop-merking strategi som baserer seg på bioorthogonal modifikasjon av AZF-GPCR-varianter i et cellebasert halv høy gjennomstrømning format. ^30. DenneMetoden utnytter flertrinnsdeteksjon egenskapene til en celle-overflate ELISA for å overvåke etiketteringshendelser.

De metoder vi diskuterer her er generelle og i prinsippet kan brukes på alle GPCR innarbeidet med AZF å bruke den gule kodonet undertrykkelse teknologi. I protokollene som presenteres her vi detalj trinnene involvert i pattedyrceller uttrykk for reseptorer innlemmet med UAAS som AZF bruker unaturlig aminosyre mutagenesis metode og deres senere søknader til rette for strukturelle og dynamiske studier av GPCRs.

Protocol

En. Stedsspesifikke Genetisk Innlemmelse av unaturlig aminosyrer inn GPCRs Oppretthold HEK293T celler i DMEM (4,5 g / l glukose, 2 mM glutamin), supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en 5% CO2 atmosfære. Transfektere cellene vokst til 60-80% samløpet i en 10-cm plate ved hjelp Lipofectamine Plus reagens. Til 750 mL DMEM, tilsett 10 mL Plus reagens, 3,5 mikrogram av GPCR cDNA (pMT4. Rho eller pcDNA 3.1. CCR5) som inneholder den gule stoppkodonet på et ønske…

Representative Results

Vi benyttet den unaturlig aminosyre mutagenese metodikk til site-spesifikt innføre molekylære prober inn en GPCR hjelp av rav kodonet undertrykkelse teknologi. Ordningen i Figur 1 skisserer de viktigste trinnene i metodikken og de ​​ulike anvendelser av å innlemme den allsidige UAA, p-azido-L-fenylalanin (AZF), inn GPCRs. Expression of AZF-GPCRs i pattedyrceller muliggjør målrettet photocrosslinking til ligander, og målrettet peptid-epitop tagging eller fluorescerende modifikasjoner a…

Discussion

Vi beskriver her en robust metode for stedsspesifikke inkorporering av en reaktiv sonde, AZF, inn GPCRs og demonstrere tre nyttige anvendelser av dette verktøyet for å studere strukturen og dynamikken i GPCRs. Vår metode for å site-spesifikt innlemme UAAS omgår et grunnleggende problem med en alternativ strategi som er basert på kjemisk merking ^{32, 33} eller feste fotokryssbindere ³⁴ til en enkelt tilgjengelig cystein mutant. Selv om kjemi som er rettet mot cystein tiol grupper har blitt brukt…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid pSVB. Yam			(Ye et al., 2008)
Plasmid pcDNA.RS for azF			(Ye et al., 2009)
Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5			Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position
HEK 293T cells			Adherent cells
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Gibco	10566
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio-products	100-106
Lipofectamine Plus	Invitrogen	Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015
p-azido-L-phenylalanine	Chem-Impex International	6162
			Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials
			[header]
Maxima ML-3500S UV-A lamp	Spectronics Corporation		azF is activated by 365-nm light
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS)	Gibco	14065
HEPES	Irvine Scientific	9319
Bovine serum albumin	Roche	3117405001
Tritium-labeled ligand			From collaborator (Grunbeck et al., 2012)
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166
NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Trans-Blot SD apparatus	Biorad		Apparatus for semi-dry transfer
Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Millipore	IPVH00010
Non-fat powered milk	Fisher Scientific	NC9934262
Tween-20	Aldrich	274348
Ecoscint A	National Diagnostics	LS-273	Scintillation fluid
Scintillation vials	Fisher Scientific	333726
LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter	Perkin Elmer		Beta-Scintillation counter
Anti-rhodopsin 1D4 mAb	National Cell Culture Center	custom
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG	KPL, Inc.	474-1806
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34080
Hyblot CL AR film	Denville	E3018
			Table 2. Targeted photocrosslinking materials
			[header]
0.25% Trypsin	Invitrogen	15050065
FLAG-triarylphosphine	Sigma	GPHOS1
M2 FLAG mAb	Sigma	F1804
anti-CCR5 2D7 mAb	BD Biosciences	555990
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
96-well plate	Costar	3601	Clear bottom, high binding EIA/RIA
Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium)	Gibco	14040
16% Paraformaldehyde	EMS	28908
HRP-conjugated	KPL, Inc.	474-1516
anti-rabbit IgG	KPL, Inc.	474-1516
Amplex Red	Invitrogen	A12222
Hydrogen peroxide	DE Healthcare Products	97-93399
CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader	Perseptive Biosystems
			Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials
			[header]
Fluorescein-phosphine			(Huber et al., submitted 2012)
Nonapeptide (C9 peptide)	AnaSpec	62190	Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner	GE Healthcare	discontinued	Scanner with 488-nm wavelength laser
			Table 4. Fluorescent labeling materials