Cre Recombinase Kokain Klima yeri tercihi Hedef Genlerin Rolü Eğitim için ifade Viral Vektörler stereotaksik Mikroenjeksiyon
Summary
Bu makalede, fare beynine viral vektörler microinject ve sonra satın alma, yok olma ve iade faz içeren klimalı yerde tercih paradigma test etmek için nasıl.
Abstract
Ilgi seçici nakavt genlere ayrı fare beyin bölgeye Cre recombinase ifade rekombinant adenoassociated viral (rAAV) vektörler microinjecting mevcut yöntemlere göre, gen silme gelişmiş zamansal ve bölgesel özel kontrol sağlar. Koşullu silme de floxed geni taşıyan fareler ile özel gen yararlanıcı kontrolü altında ifade Cre recombinase, stereotaksik mikroenjeksiyon ilgi deneyci belirlenmiş zaman noktalarında ayrık beyin bölgelerinin hedef için izin verdiği çiftleşme fareler tarafından elde edilebilir olsa. Kokain klimalı yer tercihi, ve öz-yönetim veya çekilme, yok ve / veya geri iadesi evreleri içerebilir psikomotor hassasiyet gibi diğer kokain davranışsal paradigmalar bağlamında, bu teknik bu farklı hedef genlerin eşsiz katkısı keşfetmek özellikle yararlıdır kokain bağlı plastisite davranış modelleri aşamaları. Özellikle,Bu teknik zaman karşısındaki davranışı katkılarını test etmek için bir davranış ayrık aşamaları sırasında hedef genlerin selektif ablasyonu için olanak sağlar. Sonuçta, bu anlayış bağımlılık davranışı her aşamasında kendilerini en güçlü risk faktörleri ele almak için en iyi edebiliyoruz daha hedefli tedavi sağlar.
Introduction
Kokain son derece takviye psikostimulandır. Sürekli temas halinde, çeşitli moleküler ve hücresel adaptasyon kompulsif neden olduğuna inanılmaktadır ödül-ilgili beyin devre meydana ilaç arama ciddi bir klinik sorun 1 teşkil nüks oranlarının yüksek isteyen, davranış. Kokain gen ifadesinin düzenlenmesine bu uzun süreli davranışsal etki gösterir. Kronik kokain kullanımı kaynaklanan uyarlamalar incelemek için, klinik öncesi kemirgen modelleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Böyle bir model klimalı yer tercihi (CPP) paradigma. Bu model daha önce nötr çevre ve kokain ödüllendirici özellikleri arasındaki öğrenilen bir ilişki gelişimini içerir. Belirli bir odası ile kokain birkaç eşleşmeleri sonra, hayvanların serbestçe kokain-eşleştirilmiş ve olmayan kokain-eşleştirilmiş ortamları keşfetmek için izin verilir ve ilaç-eşleştirilmiş bölmesi tercih ederseniz, bir kokain kaynaklı Plac edindikleri söyleniyore tercih. Ayrıca, bir nesli eğitim döneminden sonra, bu paradigma kokain arama davranışı bağlamında özel iade incelemek için kullanılabilir.
Bu bağımlılık taklit daha doğru olduğu düşünülmektedir uzun vadeli kokain kaynaklı davranışsal ve moleküler plastisite 2,3 ve öz-yönetim (SA) incelemek için kullanılır psikomotor hassasiyete,, gibi bağımlılık benzeri davranış diğer davranış modelleri ile karşılaştırıldığında, benzeri insanlarda bulunan davranış, CPP paradigma kokain bağlamsal öğrenme 4 incelemek için basit bir işlemdir. CPP protokolleri uygun benzer ilaç özlem ve nüks 5-7 ve hangi insan ne olacağı yönlerini özetlemek inanılıyor ilaç arama davranışı ve uyuşturucu altında yatan mekanizmaların araştırılması için izin SA, için, yok ve iade aşamaları kapsayacak şekilde genişletilebilir – ve işaret bağlı nüks 8-10.
Bir mekanizma olduğunu vurgulayansatın alma, yok, ve eski haline de dahil olmak üzere CPP en farklı aşamaları, her özelliğidir kokain-bağlı davranışsal plastisite, farklı beyin bölgeleri içinde gen ifadesinin benzersiz imza aktivasyonu. Doğrudan davranış değişiklikleri kokain-neden aracılık ödül-ilgili beyin bölgeleri içinde hangi genlerin test etmek için, bir bölgesel-belirli bir şekilde seçici onları manipüle edebilmek için yararlıdır. Bu ulaşmanın bir yolu ifade Cre recombinase LoxP siteleri (floxed fare) ile çevrili hedef genlerin sahip farelerin farklı beyin alanlara, stereotaksik cerrahi ile bu rekombinant adenoassociated viral (rAAV) vektörler microinject etmektir. Bu yöntem, ne zaman ve nerede genler bağışıklık yanıtlarını 11-13 neden olmadan, iki bölme ve olmayan bölünmesi nöronlarda, ablasyon olan üzerinde çok hassas zamansal ve bölgesel kontrol sağlar. Kontrolü bu düzeyde floxed fareler w üreme geleneksel Cre-LoxP teknolojisi üzerinden önemli bir avantajı temsilbu da, bir endojen gen promotörünün kontrolü altında Cre rekombinazı ifade i'inci farenin zamanlaması ve gen silinmesi dağılımı daha sıkı bir şekilde kontrol edilebilir. Ayrıca, viral vektör-aracılı gen nakavt geleneksel nakavt stratejileri kullanarak oluşabilecek olası gelişimsel telafi edici etkileri circumvents.
Öz-yönetim ve psikomotor hassasiyete de dahil olmak üzere ayrı aşamaları, dahil davranışsal paradigmalar ubiquitously uygulanabilir belirli genlerin rolü değerlendirmek için floxed farelerin beyin içine, burada rAAV-Cre mikroenjeksiyon açıklanmıştır kokain CPP, ek olarak. Örneğin, bizim laboratuvar kokain psikomotor hassasiyete 14 Ca v 1.2 L-tipi Ca 2 + kanalları rolünü incelemek için rAAV-Cre teknolojisi kullanmıştır. Özellikle, rAAV-Cre göstermek için gen kodlama Ca v 1.2 floxed ile farelerin nükleus akumbens (NAC), içine microinjected olduğunu Ca v </sub> 1.2 bu bölgede aracılık psikomotor hassasiyet 14,15 ifadesi aşamasında hareket. Psikomotor hassasiyete Ca v 1.3 L-tipi Ca 2 + kanalları rolünü değerlendirirken ilgi floxed gen ile fareler var yoksa Ancak, rAAV-Cre strateji kullanılamaz, olarak deneyim oldu. Koşullu fareler ilgi belirli bir gen için var yoksa bu nedenle, rAAV-Cre kullanarak bir sınırlama kendini göstermektedir. Ancak, Ca v 1.3 kanal 14,15 rolünü incelemek için yaptığı gibi ifade siRNA, demonte hedef genlerin için kullanılabilir rAAVs.
Floxed farelerin farklı beyin bölgeleri içine rAAV-Cre microinjecting ve sonra CPP paradigma bunları test çeşitli bağımlılık benzeri davranış aşamaları ve nerede hareket eden aracılık belirli genlerin soruşturma için izin verir. Bu paradigma kullanımı özünde tekrarlanan kokain yönetim br kacirilma nasıl anlayışımızda destekli vardırains ödül devresi bağımlısı devlet 1,16,17 yol açan moleküler sinyal iletim yollarının ve gen ifadesinde uyumsuz değişikliklere neden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yok ve iade aşamaları içerir CPP ile birlikte viral vektörlerin stereotaksik mikroenjeksiyon ile bölgesel ve zamansal özgü gen ablasyon bağımlılık benzeri davranış üç farklı evrelerine genlerin belirli katkıları araştırılması için izin verir. Geleneksel Cre-LoxP sistemi kullanılarak elde edilir koşullu nakavt uzay-zamansal sınırlı gen ablasyonu için sağlarken, stereotaxically floxed farelerin ayrı beyin alanlarına Cre-recombinase microinjecting ne zaman ve nerede bir gen çıkmışsa bile…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar genişletilmiş şartlı yer tercihi protokol kurma konusunda yardım için Anni Lee ve Maureen Byrne teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Conditioned place preference activity chambers | Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA | MED-CPP-MS | |
| Stereotaxic alignment system for mouse | David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA | model 900 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Company, Reno, Nevada, USA | 7634-01 | |
| rAAV2-Cre-GFP | Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA | 7016 | |
| rAAV2-GFP | Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA | 7004 |
Riferimenti
- Nestler, E. J. Molecular neurobiology of addiction. American Journal on Addictions. 10 (3), (2001).
- Thomas, M. J., Kalivas, P. W., Shaham, Y. Neuroplasticity in the mesolimbic dopamine system and cocaine addiction. British Journal of Pharmacology. 154 (2), (2008).
- Robinson, T. E., Browman, K. E., Crombag, H. S., Badiani, A. Modulation of the induction or expression of psychostimulant sensitization by the circumstances surrounding drug administration. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (2), (1998).
- Tzschentke, T. M. Measuring reward with the conditioned place preference (CPP) paradigm: update of the last decade. Addiction Biology. 12 (3-4), (2007).
- Mueller, D., Stewart, J. Cocaine-induced conditioned place preference: reinstatement by priming injections of cocaine after extinction. Behavioural Brain Research. 115 (1), (2000).
- Itzhak, Y., Martin, J. L. Cocaine-induced conditioned place preference in mice: Induction, extinction and reinstatement by related psychostimulants. Neuropsychopharmacology. 26 (1), (2002).
- Kreibich, A. S., Blendy, J. A. cAMP response element-binding protein is required for stress but not cocaine-induced reinstatement. Journal of Neuroscience. 24 (30), (2004).
- Obrien, C. P., Childress, A. R., McLellan, T., Ehrman, R. Integrating systematic cue exposure with standard treatment in recovering drug dependent patients. Addictive Behaviors. 15 (4), (1990).
- O’Brien, C. P., Childress, A. R., McLellan, A. T., Ehrman, R. A learning model of addiction. Research publications – Association for Research in Nervous and Mental Disease. 70, (1992).
- Stewart, J. Psychological and neural mechanisms of relapse. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 363 (1507), (2008).
- Bueler, H. Adeno associated viral vectors for gene transfer and gene therapy. Biological Chemistry. 380, (1999).
- Xiao, X., Li, J., McCown, T. J., Samulski, R. J. Gene transfer by adeno-associated virus vectors into the central nervous system. Experimental Neurology. 144 (1), (1997).
- Alexander, I. E., Russell, D. W., Spence, A. M., Miller, A. D. Effects of gamma irradiation on the transduction of dividing and nondividing cells in brain and muscle of rats by adeno-associated virus vectors. Human Gene Therapy. 7 (7), (1996).
- Schierberl, K., Hao, J., Tropea, T. F., Ra, S., Giordano, T. P., Xu, Q., Garraway, S. M., Hofmann, F., Moosmang, S., Striessnig, J., Inturrisi, C. E., Rajadhyaksha, A. M. Ca(v)1.2 L-Type Ca2+ Channels Mediate Cocaine-Induced GluA1 Trafficking in the Nucleus Accumbens, a Long-Term Adaptation Dependent on Ventral Tegmental Area Ca(v)1.3 Channels. Journal of Neuroscience. 31 (38), (2011).
- Schierberl, K., Giordano, T., Satpute, S., Hao, J., Kaur, G., Hofmann, F., Moosmang, S., Striessnig, J., Rajadhyaksha, A. Ca(v)1.3 L-type Ca2+ channels mediate long-term adaptation in dopamine D2L-mediated GluA1 trafficking in the dorsal striatum following cocaine exposure. Channels. 6 (1), 11-17 (2012).
- Nestler, E. J., Bergson, C. M., Gultart, X., Hope, B. T. Regulation of neural gene expression in opiate and cocaine addiction. NIDA Research Monograph. 125, (1993).
- Hyman, S. E., Malenka, R. C. Addiction and the brain: The neurobiology of compulsion and its persistence. Nature Reviews Neuroscience. 2 (10), (2001).
- Lee, A. S., Ra, S., Rajadhyaksha, A. M., Britt, J. K., De Jesus-Cortes, H., Gonzales, K. L., Lee, A., Moosmang, S., Hofmann, F., Pieper, A. A., Rajadhyaksha, A. M. Forebrain elimination of cacna1c mediates anxiety-like behavior in mice. Molecular Psychiatry. 17 (11), (2012).
- Li, X., Wolf, M. E. Visualization of virus-infected brain regions using a GFP-illuminating flashlight enables accurate and rapid dissection for biochemical analysis. Journal of Neuroscience Methods. 201 (1), 177-179 (2011).
- Ahmed, B. Y., Chakravarthy, S., Eggers, R., Hermens, W., Zhang, J. Y., Niclou, S. P., Levelt, C., Sablitzky, F., Anderson, P. N., Lieberman, A. R., Verhaagen, J. Efficient delivery of Cre-recombinase to neurons in vivo and stable transduction of neurons using adeno-associated and lentiviral vectors – art. no. 5. BMC Neuroscience. 5, (2004).
- Kaspar, B. K., Vissel, B., Bengoechea, T., Crone, S., Randolph-Moore, L., Muller, R., Brandon, E. P., Schaffer, D., Verma, I. M., Lee, K. F., Heinemann, S. F., Gage, F. H. Adeno-associated virus effectively mediates conditional gene modification in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2320-2325 (2002).
- Neve, R. L., Neve, K. A., Nestler, E. J., Carlezon, W. A. Use of herpes virus amplicon vectors to study brain disorders. Biotechniques. 39 (3), 9 (2005).
- Pohl, M., Braz, J. Gene therapy of pain: emerging strategies and future directions. European Journal of Pharmacology. 429 (1-3), (2001).
- Rinaldi, A., Marshall, K. R., Preston, C. M. A non-cytotoxic herpes simplex virus vector which expresses Cre recombinase directs efficient site specific recombination. Virus Research. 65 (1), (1999).
- Choi, V. W., McCarty, D. M., Samulski, R. J. AAV hybrid serotypes: Improved vectors for gene delivery. Current Gene Therapy. 5 (3), (2005).
- Passini, M. A., Dodge, J. C., Bu, J., Yang, W., Zhao, Q., Sondhi, D., Hackett, N. R., Kaminsky, S. M., Mao, Q. W., Shihabuddin, L. S., Cheng, S. H., Sleat, D. E., Stewart, G. R., Davidson, B. L., Lobel, P., Crystal, R. G. Intracranial delivery of CLN2 reduces brain pathology in a mouse model of classical late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis. Journal of Neuroscience. 26 (5), (2006).
- Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses – normal integration does not require viral gene-expression. Journal of Virology. 63 (9), (1989).
- Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., Omalley, K. L., During, M. J. Long-term gene-expression and phenotypic correction using adenoassociated virus vectors in the mammalian brain. Nature Genetics. 8 (2), (1994).
- Johansen, J. P., Hamanaka, H., Monfils, M. H., Behnia, R., Deisseroth, K., Blair, H. T., LeDoux, J. E. Optical activation of lateral amygdala pyramidal cells instructs associative fear learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (28), (2010).
- Zhang, F., Gradinaru, V., Adamantidis, A. R., Durand, R., Airan, R. D., de Lecea, L., Deisseroth, K. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nature Protocols. 5 (3), (2010).
