동시에 듀얼 카메라 방출 분할 시스템을 사용하여 두 개의 배출 채널의 실시간 이미지를 캡처 : 응용 프로그램은 접착 셀에
Summary
두 가지 색상의 형광 현미경을위한 듀얼 카메라 방출 분할 시스템은 뛰어난 광학 및 시간 해상도, 병렬 플레이트 흐름 챔버 접착 분석을 포함하여 특정 살아있는 세포 분석의 요구 사항과 실시간 이미지 시퀀스를 생성합니다. 소프트웨어가 동시에 취득한 발광 채널의 이미지를 병합하기 위해 사용될 때, 모조 착색 이미지 시퀀스가 생성된다.
Abstract
세포막의 특정 분자를 검출하는 다색 면역 형광 현미경 동적 유동 조건 하에서 세포 부착을 규제 메커니즘을 조사하는 평행 판 유동 챔버 분석법으로 연결될 수있다. 예를 들어, 다 형광으로 표지 된 암세포는 암 전이의 메커니즘을 모델링하는 잠재적 반응성 기판을 통해 관류 될 수있다. 그러나 실시간 라이브 세포 분석을위한 이미지 수집의 멀티 채널 단일 카메라 시스템 및 컬러 카메라 전시 단점. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 동시에 유량 용기에 형광 표지 세포의 실시간 이미지 시퀀스를 캡처하는 듀얼 카메라 방출 분할 시스템을 사용했다. 듀얼 카메라 발광 분할 시스템 필터 정의 파장함으로써 동시에이 공간적으로 동일하지만 형광 특정 화상 촬영이 모노크롬 CCD 카메라로 배열한다. 이어서, psuedocolored 1 채널 이미지는 단일로 결합실시간 세포가 관심 영역에 걸쳐 빠른 속도로 이동하는 여러 표적 분자를 공개 할 수 순서를 합병했다.
Introduction
이러한 면역 염색과 같은 세포 표면 분자를 분석하는 방법은, 화학적으로 표적 분자의 검출을 허용 형광체에 접합되는 프로브를 사용한다. 라이브 세포 이미징 및 유체 흐름 기반 세포 부착 분석법은 일반적으로 셀룰러 및 / 또는 분자 레벨 1, 2에서 생리적 과정을 포착하도록 설계된 모노크롬 CCD 카메라로 기록된다. 이 카메라는 빠른 프레임 속도 (초당 30 프레임 이상)을 제공하고, (- 빠른 프레임 속도와 짧은 노출 시간에) 뛰어난 시간 해상도를 제공, 매우 민감하다. 그러나, 흑백 카메라는 이미지를 수집하기 위해 (하나의 형광을 검출) 하나의 배출 채널을 캡처 할 수 있습니다. 단일 카메라 발광 분리 시스템은 다수의 발광 채널을 캡처 혼입하지만 종종 시야를 감소시키고 모든 채널을 이미징하는 동일한 노출 시간을 필요로 할 수있다. multip로 표지 세포의 전체 컬러 스펙트럼을 캡처하려면르는 컬러 카메라가 대안으로 사용될 수 있으며, 형광체. 그러나, 컬러 카메라는 특정 응용 프로그램에서 라이브 셀 이미징에 원하는 시간 해상도를 제공 일반적으로 할 수 없습니다. 또 다른 촬상 장치는 높은 시간 해상도를 유지하면서 다수의 파장에서 이미지 생균에 유익되는 애플리케이션을 위해 필요하다. 주요한 실험 애플리케이션은 세포 잠재적 반응성 기판 1, 3 위에 생리학 관련 조건으로 관류되는 평행 평판 유동 챔버 부착 분석법이다. 특정 세포 표면 분자를 표현 흐름에있는 세포 접착과 같은 부착 분자 또는 표면 흡착 된 세포 외 기질 단백질 (4, 5)을 발현하는 세포의 단층으로서 기판 상에 롤있다. 롤링 세포는 두 번째의 분수에 회전 및 병진 운동을 겪을 수있다. 롤링과 같은 세포 표면 분자의 클러스터를 부착 한 세포에 대한 분자의 특징도 potenti있을알은 세포 표면에 활성 개편을 받아야합니다. 따라서, 영상 시스템은 뛰어난 시간 해상도를 제공해야합니다 (초 이상 초당 30 프레임 및 노출 시간 "거의 0") 셀이 6, 7 롤링의 단계별 진행 상황을 보여줍니다 이미지 시퀀스를 생성 할 수 있습니다. 듀얼 카메라 발광 분리 시스템은 다수의 형광으로 표지 된 세포 이미징을위한 이러한 요구를 충족시킬 수있다.
이중 사진기 방출 분할 시스템보기의 전체 필드를 유지하면서 동시에 두 개의 공간적으로 동일하지만 형광 고유의 이미지를 캡처하는 두 개의 유사한 카메라에 필터 형광 채널을 분할. 이 기술은 각 채널에서 실시간으로 촬영 된 화상의 직접적인 비교를 가능하게하고, 사용자가 신속하게 다른 이미징 기능과 카메라 모델 사이를 전환 할 수있다. 이 기능은 더 나은 시스템을 캡처 할 수있는 하나의 카메라에서 이미지 캡처 설정을 조정하는 데 유용합니다다른 강도, 수명, 그리고 멸종 계수 8 형광. 이미징 소프트웨어와 결합, 듀얼 카메라 방출 분할 시스템은 여러 파장의 라이브 셀 이미징 분석의 실시간 기록을 허용하고 세포 행동을 연구하기 위해 형광을 사용하여 시험 관내 분석을 향상시킬 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
듀얼 카메라 방출 분할 시스템은 세포 또는 분자 운동이 급속 응용 프로그램에서 높은 품질의 이미지를 캡처하는 데 필요한, 공간 시간 및 광학 해상도를 가지고 있습니다. 대표적인 결과를 생성, 소프트웨어 설정 및 카메라 설정을 포함하여 듀얼 카메라 방출 분할 시스템의 매개 변수는, 압연 부착 세포가 공간적으로 시간적으로 정렬 된에 병합 된 이미지 시퀀스를 얻기 위해 최적화되었다. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 통찰력 토론과 원고 검토를 위해 박사 더글러스 게츠 (학과 화학 및 생명 공학, 오하이오 대학) 박사 파비안 Benencia (바이오 메디컬학과, 오하이오 대학) 감사드립니다. 우리는 또한 도움이 기술 토론 (W. Nuhsbaum 주) 박사 크리스토퍼 Huppenbauer 감사합니다. 이 작품은 건강의 국립 과학 재단 (CBET-1106118)과 국립 연구소 (1R15CA161830-01)에서 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Reagent/Material | |||
| BT-20 cells | ATCC | HTB-19 | |
| CHO-E cells | Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School) | ||
| MEM | Thermo Scientific | SH30024.01 | |
| FBS | Thermo Scientific | SH30396.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin / 0.1% EDTA | Thermo Scientific | SV30031.01 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| HECA-452 monoclonal antibody | BD Biosciences | 555946 | |
| Anti-human CD24 monoclonal antibody | BD Biosciences | 555426 | |
| Anti-rat IgM AlexaFluor 488 | Invitrogen | A21212 | |
| Anti-mouse IgG AlexaFluor 568 | Invitrogen | A11004 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera | Q Imaging | EXI-BLU-R-F-M-14-C | |
| Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera | Q Imaging | RET-EXi-F-M-12-C | |
| DC2 Emission Splitter | Photometrics | DC2 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Streampix 5 software | Norpix |
Riferimenti
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