Il metodo Tomato / GFP-FLP / FRT comporta la visualizzazione cellule fotorecettrici mosaico nel vivere Drosophila. Può essere usato per seguire singoli destini delle cellule fotorecettrici nella retina per giorni o settimane. Questo metodo è ideale per gli studi di degenerazione retinica e di malattie neurodegenerative o lo sviluppo delle cellule fotorecettori.
L'occhio Drosophila è ampiamente usato come modello per studi di sviluppo e degenerazione neuronale. Con il potente tecnica mitotico ricombinazione, eleganti schermi genetici basati su analisi clonale hanno portato alla identificazione di vie di segnalazione coinvolte nello sviluppo dell'occhio e fotorecettori (PR) la differenziazione nelle fasi larvali. Descriviamo qui il metodo Tomato / GFP-FLP / FRT, che può essere utilizzato per una rapida analisi clonale negli occhi della vita adulta Drosophila. Cellule fotorecettrici fluorescenti vengono esposte con la tecnica cornea neutralizzazione, sulla retina con cloni mosaico generati mediante ricombinazione flipase-mediata. Questo metodo presenta alcuni importanti vantaggi rispetto classica sezionamento istologica della retina: può essere utilizzato per screening ad alto rendimento e si è dimostrato un metodo efficace per identificare i fattori che regolano la sopravvivenza e la funzione PR. Può essere usato per analisi cinetiche di PR degenerazione nella stessa anim soggiornoAl diverse settimane, per dimostrare la necessità di geni specifici per la sopravvivenza PR o funzione nella mosca adulta. Questo metodo è anche utile per affrontare problemi di autonomia cella mutanti sviluppo, come quelli in cui l'istituzione della polarità cellulare planare è interessato.
La retina Drosophila è composto da circa 800 unità ommatidial (Figura 1A), organizzati appunto, con un asse ben definito di polarità (Figura 1B). Ogni unità contiene 20 celle: otto cellule fotorecettrici (PRS) e 12 cellule accessorie, comprese le cellule dei coni, cellule pigmentate e setole cellule 1,2. Due classi di PR si distinguono in base al tipo di rodopsina (Rh) esprimono. I sei PR esterne (R1-6) esprimono Th1 e sono disposte in un modello trapezoidale (Figura 1C). Nel centro del trapezio, i due PR interni (R7/R8) esprimono quattro possibili tipi di rodopsina (RH3, RH4, RH5 o RH6) e sono organizzati in modo tale che R7 si trova sulla cima di R8 3.
Più di 2.500 geni sono coinvolti nella morfogenesi dell'occhio Drosophila 4, che si è dimostrato un modello molto potente per studi di un ampio pannello di processi, compresi svi occhioluppo, PR reclutamento, la differenziazione, la polarità planare delle cellule, morfogenesi, la sopravvivenza, l'apoptosi e trasduzione visiva 5-9.
I ricercatori che lavorano sugli occhi Drosophila hanno, nel corso di molti anni, le tecniche di imaging della retina e la realizzazione di schermi genetici sistematici sviluppato. Il modo più semplice per l'immagine della retina adulta è quello di esaminare la cornea in un animale immobilizzato (Figura 1A). La struttura della cornea può essere visualizzata con precisione da microscopia elettronica a scansione ed è stato utilizzato in uno screening genetico su larga scala dal consorzio URCFG ( http://www.bruinfly.ucla.edu ) 10. Questo è un approccio molto efficace per la visualizzazione di cambiamenti globali morfologiche nella struttura corneale, come rugosità degli occhi o lucentezza, spesso indotte da mutazioni in geni che controllano i primi passi nello sviluppo o la vitalità cellulare. Tuttavia, visualizzazione globale della cornea non è sufficiente di identificare i fattori che regolano PR rhabdomere morfogenesi o adulto PR vitalità e funzione. Tali analisi richiedono un esame approfondito più di integrità PR, basato sulla microscopia a contrasto di fase di sezioni in resina semi-sottili tangenziali della retina 11-13. Questa tecnica è adatta per analisi di mosaico, in cui PR mutanti possono essere identificati dalla loro mancanza di pigmento rosso 14,15.
Cloni mutanti mosaico possono anche essere visualizzati in dissezioni tutto il montaggio della pupa o adulto retina, sulla base della loro mancanza di proteina fluorescente verde segnale (GFP) sulla fluorescenza microscopia 16,17. Queste due tecniche sono molto utili, ma entrambi sono-lavoro e che richiede tempo e non sono quindi adatti per lo screening su larga scala. Noi e altri abbiamo sviluppato l'uso di tecniche cornea neutralizzazione per l'imaging di PR producono proteine fluorescenti 18,19, per facilitare l'analisi rapida PR. Con questa tecnica, mutantecloni possono essere identificati sulla base della autofluorescenza della (w +) pigmento rosso in mosaico adulti Drosophila cloni. Tuttavia, questo metodo non fornisce la risoluzione unicellulare necessaria per combattere autonomia cella emette 19. Abbiamo superato questo problema sviluppando il metodo di pomodoro / GFP-FLP / FRT, che combina l'imaging di proteine fluorescenti da cornea neutralizzazione con ricombinazione mitotica 20. Questo metodo consente la-throughput elevato, rapida e precisa identificazione delle PR mutanti in cloni di mosaico, con risoluzione unicellulare ( http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/ ). E 'adatto per l'uso nelle analisi cinetiche, per questi singoli SPE in un periodo di settimane nel vivere Drosophila. Descriviamo qui il metodo Tomato / GFP-FLP / FRT e suggerimenti per il suo utilizzo in semplici, analisi cinetiche degli occhi mosaico.
L'occhio Drosophila è stato ampiamente utilizzato per decifrare le vie di segnalazione che regolano lo sviluppo, la proliferazione e la sopravvivenza. Nei primi anni 1990, un gran numero di schermi genetici sono stati effettuati per identificare i percorsi necessari durante le fasi iniziali dello sviluppo PR 25-27. L'efficienza degli schermi genetici è stata aumentata notevolmente con la tecnica di ricombinazione mitotica, che consente di testare perdita-di-funzione mutazioni nei cloni mosaico 21. Quindi, il ruolo delle mutazioni letali embrionali potrebbe essere testato sistematicamente in cloni mutanti omozigoti negli occhi di mosche che erano altrimenti eterozigoti. La maggior parte delle proiezioni mosaico si sono concentrati sui primi PR reclutamento, la differenziazione, la proiezione assonale o morfogenesi che si verificano nelle larve o pupe di sviluppo 10,25-31. Ad oggi, solo una schermata mosaico ha indagato i meccanismi che regolano la funzione adulto PR, attraverso il monitoraggio della risposta visiva tramite electroretinOgram Registrazioni 32. Con il metodo Pomodoro / GFP-FLP / FRT e la possibilità di effettuare analisi andamento nel tempo a vivere animali mutanti, abbiamo progettato un nuovo metodo per identificare i fattori che regolano la vitalità PR adulti e funzionamento 20,24.
Il metodo Tomato / GFP-FLP / FRT ha diversi importanti vantaggi rispetto al sezionamento istologico classico occhi di resina-embedded. In primo luogo, questo metodo è molto più veloce, più economico e più facile da eseguire rispetto al metodo istologico, a condizione che un microscopio a fluorescenza dotato di un adeguato obiettivo di immersione acqua è disponibile (vedi Tabella di reagenti e attrezzature). In secondo luogo, il metodo di pomodoro / GFP-FLP / FRT può essere utilizzato in combinazione con l'espressione del transgene, come l'espressione di P (UAS, w +), portando un mini-bianco transgene. In contrasto con sezioni istologiche, in cui viene utilizzato w + per il rilevamento clonale, nel sistema Pomodoro / GFP-FLP / FRT, P (UAS, w +) non interferisce con clonale detection basato sulla proteina fluorescente Pomodoro. Utilizzando P (UAS-FATP, w +) mosche transgeniche, siamo stati in grado di visualizzare in soccorso di PR mutanti FATP (Figura 7). In terzo luogo, un trabocchetto chiave di tutti i tipi di analisi clonale, compresa quella basata sulla Tomato / GFP-FLP / FRT, è l'ambiguità del genotipo di PR perduti. Infatti, può essere chiaro se un PR è assente a causa della mancanza di una funzione gene specifico oa causa di una cella effetto non autonomo, in particolare al confine del clone mutante. Il metodo Tomato / GFP-FLP / FRT aggira questo problema per degenerazione rendendo possibile seguire wild-type e mutanti PR nello stesso animale su periodi di diverse settimane. Siamo stati in grado di seguire il destino dei singoli PR di cinetica analisi su diversi FATP mosche mutanti (Figura 6). Lo stesso clone può essere riconosciuto in un determinato animale in tempi diversi, a causa della forma precisa delle wild-type circostanti cloni. Siamo stati in grado di mostrare inequivocabilely che tutte le PR mancanti erano mutante per FATP, indicando che il ruolo di mutanti FATP in PR è la cellula-autonoma. Pertanto, monitorando la perdita di PR in una analisi cinetica, è possibile determinare il genotipo di PR in modelli di adulto-inizio degenerazione. Infine, il metodo di pomodoro / GFP-FLP / FRT è dimostrato molto potente per l'identificazione dei fattori che regolano la costituzione del PCP 20. La possibilità di aver realizzato un gran numero di ommatidia mosaico per un fenotipo polarità senza la necessità di sezioni, facilita la rapida determinazione del requisito PR per la creazione di PCP. Tuttavia, analisi più fine dell'integrità PR richiederebbe taglio tradizionale seguita da contrasto di fase o di microscopie elettroniche.
In conclusione, il metodo di pomodoro / GFP-FLP / FRT apre nuove possibilità per lo screening mosaico efficace per identificare i fattori che regolano i processi di sviluppo di pubbliche relazioni e funzioni adulti di PR, come la visrisposta manuale e la vitalità.
The authors have nothing to disclose.
PLATIM e Droso-Tools strutture del UMS3444 Biosciences, Lione, Francia. La ricerca di BM è stata sostenuta da sovvenzioni dal Fondation pour la Recherche Médicale dal CNRS (ATIP) e l'ANR-12-BSV1-0019-01. PD è stato supportato da Retina Francia associazione e l'Ecole Normale Supérieure di Lione (Francia). CL è stato supportato da La Ligue Nationale contre le Cancer Association.
Reagent | |||
Agarose | Euromedex | D5-E | Regular agarose is used to immobilize the flies |
Petri dish | BD Falcon | 353001 | 35 x 10 mm, 1.37 x 0.39 inch |
Cold-ice water | To maintain the flies anesthetized | ||
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Equipment | |||
Dissecting microscope | Dutcher | SMZ645 | |
Water Bath | Julabo | 9550102 | To keep the agarose solution at warm temperature |
40X Water objective | Zeiss | 420967-9900-000 | Water dipping objective for the confocal microscope |