L'isolamento di epatociti umani da un Two-step Collagenase perfusione procedura
Summary
A due fasi procedura di perfusione con collagenasi modificata per l'isolamento di epatociti umani è descritta. Questo metodo può essere applicato anche ad altri fegati mammiferi. Gli epatociti isolati sono disponibili in alta resa e redditività, che li rende un modello adatto per la ricerca scientifica in settori quali la rigenerazione epatica, farmacocinetica e tossicologia.
Abstract
Il fegato, un organo con una capacità di rigenerazione eccezionale, svolge un'ampia gamma di funzioni, quali la disintossicazione, il metabolismo e l'omeostasi. Come tale, gli epatociti sono un modello importante per una grande varietà di domande di ricerca. In particolare, l'uso di epatociti umani è particolarmente importante nel campo della farmacocinetica, tossicologia, rigenerazione epatica e ricerca traslazionale. Così, questo metodo presenta una versione modificata di una procedura in due fasi perfusione con collagenasi per isolare epatociti come descritto da Seglen 1.
In precedenza, gli epatociti sono stati isolati con metodi meccanici. Tuttavia, i metodi enzimatici hanno dimostrato di essere superiore come epatociti mantengono la loro integrità e la funzione strutturale dopo l'isolamento. Questo metodo qui presentato si adatta il metodo precedentemente progettata per fegati di ratto a pezzi di fegato umano ed i risultati in un grande rendimento di epatociti con agibilità di 77 ± 10%. Il principaledifferenza di questa procedura è il processo di cannulization dei vasi sanguigni. Inoltre, il metodo qui descritto può essere applicato anche ad fegati da altre specie con malattie epatiche o vaso sanguigno dimensioni comparabili.
Introduction
Una sospensione di cellule di fegato può essere preparato dal fegato con metodi meccanici o enzimatici. Metodi meccanici utilizzati per preparare le cellule del fegato includono intere costringendo il fegato attraverso una garza 2, agitando un pezzo di fegato con perle di vetro in uno shaker Kahn 3, utilizzando omogeneizzatori vetro con pestelli sciolti 4,5 ecc Nel corso degli anni, metodi meccanici sono caduti fuori favorire causa dei danni alle membrane cellulari e la perdita della funzione degli epatociti isolati 6,7. Di conseguenza, l'uso di un metodo enzimatico è attualmente il metodo principale per l'isolamento di epatociti.
Isolamento di epatociti utilizzando un metodo enzimatico è stata notevolmente migliorata quando Berry e Friend 8 perfusi collagenasi e ialuronidasi attraverso il fegato attraverso la vena porta nei ratti. Questo processo perfusione utilizzato il sistema vascolare per consentire gli enzimi di entrare in stretto contatto con la maggior parte delle cellule, portando adun aumento di 6 volte della resa degli epatociti 8. Inoltre, questo metodo ha prodotto cellule che mantenevano la loro integrità strutturale, praticamente senza trasformazione del reticolo endoplasmatico in vescicole isolate e nessun danno mitocondriale 8.
Questo metodo è stato modificato da Seglen 1, che ha aperto una procedura di perfusione in due fasi per l'isolamento delle cellule epatiche. In questa procedura, il fegato di ratto è perfuso con un Ca 2 + tampone privo seguita da perfusione con collagenasi un tampone contenente Ca 2 + 1. La rimozione di Ca 2 + nel primo passaggio consente di interrompere desmosomi, mentre è necessaria l'aggiunta di Ca 2 + nel secondo passo per un'attività ottimale collagenasi 1,9.
Dato che il lavoro pubblicato sopra descritto è stato eseguito su ratti, questo articolo si propone di dimostrare una procedura modificata che può essere utilizzato per l'isolamento di epatociti con alta vitalità da Humun fegati. L'uso di epatociti umani rimane importante per la ricerca traslazionale e per validare gli esperimenti su modelli animali. I pezzi di fegato umano utilizzati in questo studio sono stati acquisiti con il consenso della governance attraverso il tessuto umano e Cell Research Foundation, una controllata dallo Stato fondazione non-profit 10. Dopo un patologo rimosso a quanto necessario per la diagnosi, pezzi di fegato sono stati raccolti dal tessuto rimanente. Il tessuto sezionato fuori dal patologo era morfologicamente il tessuto sano ottenuto da margini di resezione dopo resezione epatica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo comporta l'isolamento di epatociti umani con alta vitalità e purezza. Per conseguire questi risultati, è importante iniziare con un pezzo adatto di fegato. Il pezzo di fegato dovrebbe avere capsula integra di Glisson su tutte le superfici tranne per 1 superficie di taglio. Un altro fattore importante è la particolare lotto di collagenasi utilizzato, come gruppi differenti possono provocare notevoli differenze Viabilità di epatociti dopo digestione 11. Pertanto, diversi lotti di colla…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato reso possibile dal tessuto e Cell Research Foundation umano, che rende i tessuti umani disponibili per la ricerca. Il sostegno finanziario per questo lavoro è stato ricevuto dal Ministero Federale dell'Educazione e della Ricerca (nome di sovvenzione: Virtual Network Fegato, numero di concessione: 0.315.759) e Hepacult GmbH. I nostri ringraziamenti vanno anche agli assistenti tecnici della Banca dei tessuti Grosshadern Hospital per la raccolta dei campioni di fegato e gli assistenti tecnici del isolamento delle cellule Nucleo Fondo per l'esecuzione della perfusione epatica e l'isolamento degli epatociti. In particolare, vorremmo ringraziare Natalja Löwen per dimostrare questa procedura nel video. Infine, vorremmo ringraziare Natalja Löwen e Edeltraud Hanesch per creare le illustrazioni per la figura 1 e le figure nella panoramica schematica del video.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble trap | Gaßner Glastechnik | ||
| Glass jacketed condenser | Gaßner Glastechnik | ||
| 41 °C Water bath | Julabo | 35723-H24/EG | |
| 37 °C Water bath | GFL | 1083 | |
| Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2) | Linde | ||
| Gas permeable tubing | Neolab | 2-4440 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | IP65 | |
| Scalpel | Feather | 320010 | |
| Forceps | Omnilab | 5171014 | |
| Conical flasks 1 L | Schott Duran | 2121654 | |
| Conical flasks 5 L | Schott Duran | 2121673 | |
| Beakers | Schott Duran | 2110654 | |
| 200 ml centrifuge tubes | Becton Dickinson | 352075 | |
| Crystallizing dish | Omnilab | 5144063 | |
| Curved irrigation cannulae with ball tips | Ernst Kratz GmbH | 1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL | |
| Micro vascular clamps | Ernst Kratz GmbH | ||
| Büchner funnel | Carl Roth | HT38.1 | |
| Nylon mesh 210 μm | Neolab | 4-1413 | |
| Nylon mesh 70 μm | Neolab | 4-1419 | |
| 0.22 μm sterile filters | Peske | 99505 | |
| 500 ml bottles | Schott Duran | 2180144 | |
| 1 L bottles | Schott Duran | 2180154 | |
| Hemocytometer | Peske | 06-0001 | |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 0030 120,086 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Ice bucket | Neolab | 1508454 | |
| Sterile Pasteur pipettes | Brand | 747715 | |
| Motorised pipette filler (Pipette boy acu) | Integra | 155017 | |
| Refridgerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Laminar flow | Kendro | Hera safe-KS9 | |
| Aspirator (Low-flow surgical suction pump) | Atmos | C361 | |
| Laboratory Gas Burner | Integra | Fire Boy eco | |
| Disposable laboratory coat | Paperlynen GmbH | MD0202414 | |
| Surgical mask with visor | Kimberly-Clark | 48247 | |
| Surgical hood | Barrier | 42072 | |
| Latex gloves | Semper Care | CE0321 | |
| Collagenase (Batch number NB 4G) | Serva | 17465 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 2382 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Sodium chloride | Roth | 9265.2 | |
| Hepes | Roth | 9105.3 | |
| Potassium chloride | Serva | 26868 | |
| Albumin | Biomol | 01400-2 | |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Serva | 30180 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Lonza | 17-942E | |
| Cold storage solution | Hepacult GmbH |
Riferimenti
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