Motor Nerve transection og Time-lapse Imaging av Glial Cell atferd Live Sebrafisk
Summary
Selv om det perifere nervesystemet (PNS) er i stand til betydelig reparasjon etter skade, er lite kjent om de cellulære og molekylære mekanismer som styrer dette fenomenet. Ved hjelp av levende, transgen sebrafisk og en reproduserbar nerve transection analysen, kan vi studere dynamiske glial celle atferd under nerve degenerasjon og regenerasjon.
Abstract
Den nervesystemet blir ofte beskrevet som en fastkablet komponent av kroppen selv om det er et betydelig væske organ som reagerer på ytre stimuli på en konsekvent, stereotyp måte, og samtidig opprettholde en utrolig fleksibilitet og plastisitet. I motsetning til det sentrale nervesystemet (CNS), i det perifere nervesystemet (PNS) i stand til vesentlig reparasjon, men vi har nettopp begynt å forstå de cellulære og molekylære mekanismer som styrer dette fenomenet. Ved hjelp av sebrafisk som modell system, har vi den enestående muligheten til å par regenererende studier med in vivo avbilding og genetisk manipulasjon. Perifere nerver er sammensatt av aksoner omgitt av lag av gliaceller og bindevev. Axoner er ensheathed ved myelinating eller ikke-myelinating Schwann celler, som i sin tur er pakket inn i en fascicle av en mobil skjede kalt perineurium. Etter en skade, voksen perifere nerver har bemerkelsesverdig evne til remove skadet axonal rusk og re-innervate mål. For å undersøke rollene til alle perifer gliaceller i PNS gjenfødelse, beskriver vi her en axon transection analysen som bruker en kommersielt tilgjengelig nitrogen-pumpet dye laser til axotomize motoriske nervene i levende transgen sebrafisk. Vi videre beskrive metoder for å koble disse eksperimentene til time-lapse avbildning av skadde og kontroll nerver. Denne eksperimentelle paradigmet kan brukes til å ikke bare vurdere rollen som glia spiller i nerve gjenfødelse, men kan også være plattformen for å belyse de molekylære mekanismene som styrer nervesystemet reparasjon.
Introduction
Sebrafisk har vært brukt mye til å studere utviklingen av nervesystemet på grunn av deres optisk transparens og enkel transgenesis, som når kombinert, gir mulighet for spektakulære avbildning av dynamiske celle atferd i et levende embryo. I tillegg, fordi sebrafisk og pattedyr dele nesten alle gener som kreves for nervesystemet formasjon, cellulært og molekylært informasjon som er samlet i denne modellen organisme er direkte relatable til andre arter virveldyr. Selv om utrolig kraftig for nevrale utviklingsstudier, sebrafisk og dets unike egenskaper har potensial til også å belyse mekanismene som opprettholder og gjenoppbygge nervesystemet etter skade. Sebrafisk larver opprettholde sin gjennomskinnelighet i sene larvestadier og pigmentering kan være effektivt blokkert med enten bruk av farmakologiske hemmere av melanin produksjon eller genetiske mutanter som mangler pigment celler. Derfor, for å bruke denne modellen organisme studere skade og regeneration i eldre dyr er mulig og tilbyr en unik mulighet til å direkte undersøke cellulære og molekylære mekanismer som gjenoppbygge nervesystemet. I dette manuskriptet, beskriver vi hvordan du effektivt og reproduserbar skade nerver i PNS av sebrafisk larver. Denne skaden paradigmet gir seg til å studere ikke bare degenerasjon, men også svarene på perifer gliaceller og immunceller samt interaksjoner mellom disse populasjonene under regenerering.
PNS er et komplekst nettverk av motoriske og sensoriske nerver som er nødvendig for å sende informasjon mellom det sentrale nervesystemet (CNS) og i huden, muskler og organer i kroppen, slik at en organisme for å samhandle med omgivelsene og overleve. Langs disse nerver, perifer gliaceller, inkludert myelinating og ikke-myelinating Schwann-celler og perineurial gliaceller, samt bindevev, omslutter aksoner og slutt danner den modne nerve. Skade av disse nervene initierer en prosess known som Wallerian degenerasjon 10. Denne mekanismen av aksonal fragmentering, immun rekruttering, rusk klarering og gjenfødelse er veldig stereotyp og genetisk regulert en. Tidligere studier i mammalske systemer har beskrevet rollene som Schwann celler under nerve degenerasjon og en gjenfødelse, 2, 6, 8. I disse studier av fast vev eller cellekultur, Schwann cellene ikke bare rekruttert makrofager til skaden området for å hjelpe til med rusk klaring, men også hjulpet i myelin fagocytose selv. Mens disse studiene har vært utrolig lærerikt, vi har aldri før visualiserte glial svar på perifer axon skade in vivo i sanntid, og ingen andre studier har undersøkt sammenhengen mellom de forskjellige klasser av perifer gliaceller i løpet av disse hendelsene.
Nylig har flere laboratorier undersøkt Wallerian degenerasjon bruker sebrafisk og laser-mediert axon skade som ligner på det vi beskriver her <sup> 4, 5, 7, 9. I noen av disse studiene ble det overfladiske sensoriske axoner axotomized i ung larver ved hjelp av en spesialbygget, to-foton konfokalmikroskop 4, 5, 9. I en annen studie, som er svært lik vår egen, ble dypere axoner innenfor ventrale motor nerve transektert i fem dager gamle larver ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig laser ablasjon system 7. I begge disse eksperimentelle set-ups, var fokus på Wallerian degenerasjon og begge axoner og immunceller ble fotografert. For å utdype disse studiene beskriver vi skadet motoriske axoner i eldre larver med mer modne, myelinerte nerver og analyse responsen til alle nerve-assosiert perifer glia under degenerasjon og regenerasjon.
For å gjøre dette, transekt vi motoriske nerver i 6 og 7 dag etter befruktning (DPF) larver og visualisere svarene av individuelle glial bestander samt undersøke samspillet mellom disse populasjonene langs skadde axoner. Ved hjelp av dobbel og trippel transgenic linjer som etiketten perifer gliaceller, inkludert Schwann celler og perineurial gliaceller, samt en markør for axoner, bruker vi en kommersielt tilgjengelig laser ablasjon system som består av en nitrogen-pumpet dye laser (bølgelengde 435 nm) som er festet til en roterende disk confocal system å skape axon transections. Dette eksperimentelle oppsettet tillater oss å visualisere levende, larvenes sebrafisk, skade bestemte perifere motoriske axon traktater og time-lapse bilde svarene av forskjellige glial populasjoner til axon skade og deres forhold til hverandre. Denne protokollen kan videre tilpasses for å skape nerve skader i sebrafisk i ulike aldre, med ulike transgene linjer eller genetiske mutanter for å løse ulike vitenskapelige spørsmål.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mest kritiske trinn av denne eksperimentelle design er: 1) riktig montering larver for skade og påfølgende in vivo avbildning og 2) kalibrering av laseren og velge de riktige effektinnstillinger for å lage et rent nerve transection som resulterer i minimal ekstra-vevsskade . For å sikre en vellykket axotomy for in vivo avbilding og påfølgende analyse, montere flere larver i enten individuelle glassbunn retter eller i en glassbunn fatet med skillevegger. Etter kalibrering av laser, anbefaler vi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Kucenas Lab for verdifulle diskusjoner og Quorum Technologies, Inc. for suveren teknisk support. Arbeidet ble støttet av UVA Fund for Excellence in Science and Technology (FEST) (SK).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629-100G |
| Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222 | Argent Chemical | C-FINQ-UE-100G |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414-10G |
| Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One | VWR/Greiner | 89125-444 |
| Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick | Willco Wells | GWSt-3512 |
| MicroPoint Laser System with all components | Andor Technology – purchased through Quorum Technologies, Inc. | 2203-SYS |
| MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm) | Andor Technology | MP-27-435-DYE |
Riferimenti
- Geuna, S., et al. Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).
- Hirata, K., Kawabuchi, M. Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during Wallerian degeneration. Microsc. Res. Tech. 57, 541-547 (2002).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Martin, S. M., O’Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning. Development. 137, 3985-3994 (2010).
- O’Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (24), e1129 (2009).
- Parrinello, S., et al. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 143, 145-155 (2010).
- Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J. Neurosci. 32, 3898-3909 (2012).
- Stoll, G., Muller, H. W. Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights. Brain Pathol. 9, 313-325 (1999).
- Villegas, R., Martin, S. M., O’Donnell, K., Carrillo, S., Sagasti, A., Allende, M. L. Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types. Neural Development. 7, 19 (2012).
- Waller, A. Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations pro- duced thereby in the structure of their primitive fibres. Philos. Trans. R. Soc. Lond. , 423-429 (1849).
