생활 효모 세포에서 미토콘드리아 산화 환원 상태와 ATP를 측정 비례 바이오 센서

Summary

우리는 살아있는 효모 세포에서 세포 내 해상도에서 미토콘드리아의 산화 환원 상태와 ATP 수준을 모니터링하기 위해, GFP를 기반으로하는 두 개의 비례, 유전자 인코딩 바이오 센서의 사용을 설명합니다.

Abstract

미토콘드리아는 에너지 대사와 세포의 수명과 프로그램 된 세포의 죽음으로 제어하는​​ 칼슘 항상성에서 많은 세포 과정에있는 역할을한다. 이러한 프로세스는 영향의 산화 환원 상태와 미토콘드리아 ATP 생산에 의해 영향을받습니다. 여기, 우리는 효모 세포를 생활에 세포 내 해상도에서 미토콘드리아의 산화 환원 상태와 ATP 수준을 감지 할 수있는 두 개의 비례, 유전자 인코딩 바이오 센서의 사용을 설명합니다. 미토콘드리아의 산화 환원 상태는 미토콘드리아의 매트릭스를 대상으로 산화 환원에 민감한 녹색 형광 단백질 (roGFP)를 사용하여 측정됩니다. 미토 roGFP 차례로 단백질의 여기 스펙트럼을 변경 가역 및 환경에 따라 산화와 환원을 거쳐 위치 147과 GFP의 204의 시스테인이 포함되어 있습니다. MitGO-ATeam은 F _오의 ε 소단위가 F _1-ATP 합성 효소를 사이에 끼워 넣으면되는 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 프로브는 기증자와 수용체 플루오을 무서워rescent 단백질. 을 가지고 단백질의 형태 변화 ε 소단위 결과로 ATP의 결합은 가까운 곳에서 기증자와 수용체를 무서워하고 기증자의 수용체에 형광 공명 에너지 전달을 허용합니다.

Introduction

미토콘드리아는 아미노산, 지방산, 헴, 철, 황 클러스터 및 피리 미딘의 ATP 생산 생합성에 필수적인 세포 소기관이다. 미토콘드리아는 칼슘 항상성에 중요한 역할을하고, 세포 사멸 조절합니다. 파킨슨 병, 알츠하이머 병, 루게릭 병, 헌팅턴의 질병 등 노화 및 노화 관련 질병에 미토콘드리아 ¹ 증가 증거 링크 ^2. 개인이 자신의 전체 삶을 살 수 있지만 퇴행성 신경 질환과 관련된 미토콘드리아 단백질에 돌연변이가 질병의 증상은 생활에서 나중에 발생합니다. 이것은 변경이 등장하는 병리 질환을 허용 연령 미토콘드리아에서 발생 나타냅니다. 사실, 미토콘드리아 피트니스은 전체 세포의 건강과 수명 효모와 포유 동물 세포와 연관되어 있습니다. 여기서 ^3,4, 우리는 mitoc의 두 가지 중요한 기능을 평가하기 위해 유전자 인코딩, 비례 형광 바이오 센서를 사용하는 방법에 대해 설명합니다효모 세포를 살아있는 hondria : 산화 환원 상태와 ATP 수준.

유산소 에너지 동원 미토콘드리아의 기능이 제대로 설정됩니다. 미토콘드리아의 산화 환원 상태는 NAD ⁺ / NADH, FAD / FADH _2, NADP ⁺ / NADPH, 글루타티온 / 글루타티온 아황산 (GSH / GSSG)와 활성 산소 종 (reactive oxygen species, ROS) 등 세포 기관에 종을 감소시키고 산화의 제품입니다. 미토콘드리아 또는 저산소증 연결을 풀기는 미토콘드리아의 호흡 활동에 영향을 미치는 NAD의 비율 ⁺ 세포 소기관에서 NADH로 변경합니다. 미토콘드리아 막에있는 전자 수송 사슬의 복합체뿐만 아니라, 아민의 탈 아미노 반응에서 외부 미토콘드리아 막에있는 모노 아민 산화 효소를 통해 ^5, 손상 지질, 단백질, 핵산 간의 비효율적 인 전자 전달에서 생산이됩니다 ROS, ^{6,7,8 노화} 및 노화 관련 퇴행성 신경 질환에 연결되었습니다. ROS는 M의 신호 전달에 중요한 역할을itochondria, GSH의 산화를 통해. 예를 들어, NADH 탈수소 효소는 ROS 생산에 기여뿐 아니라 글루타티온 풀 ^9,10와의 상호 작용을 통해 조절된다. α-Ketoglutarate 탈수소 효소와 aconitase, TCA 사이클의 구성 요소는 환경에게 ^{11,12 산화} 감소 활동을 나타냅니다.

사실, aconitase 활동의 산화 환원에 의존 규제 박테리아 포유류 ^13,14에 보존됩니다. 따라서, 산화 환원 상태와 미토콘드리아의 ATP 수준을 모니터링하는 것은 질병 병리에서의 기능과 역할을 이해하는 데 매우 중요합니다.

생화학 적 방법은 산화 환원 상태 또는 전체 세포의 ATP 수준을 평가하는 데 사용 또는 미토콘드리아 고립되었다. 전체 세포 또는 산화 환원 상태를 평가하기 위해 널리 사용되는 방법은 미토콘드리아 격리는 산화 환원 쌍 GSH / GSSG ^15의 수준을 측정하는 기준으로합니다. 루시페린 – 루시퍼 시스템은 일반적으로 미토콘드리아 측정하는 데 사용됩니다미토콘드리아 투과 전체 세포 또는 고립 된 하나의 ATP 수준. ^{16,17,18,19,20이} 분석에서, 루시 페라 제는 양에 비례 ATP에 바인딩과의 산화 루시페린에서 발광을 촉진. ²¹ 방출되는 빛의 강도 반응 혼합물에서 ATP. ²²

이러한 방법은 알츠하이머 질환과 같은 퇴행성 신경 질환을 가진 환자는 비정상적으로 낮은 ATP 수준을 가지고 찾는 등의 미토콘드리아 기능에 대한 기본적인 정보를 공개했다. ²³ 그러나 그들은 이미지의 생활 그대로 셀에 사용할 수 없습니다. 또한, 전체 세포 분석에 근거한 방법은 산화 환원 상태 나 세포의 구획 ATP 수준의 평균을 제공합니다. 미토콘드리아의 산화 환원 상태 나 ATP 수준은 세포 내 분획 중 변경 될 수 있기 때문에 고립 된 세포 소기관의 측정은 잠재적 인 문제가 있습니다. 마지막으로, 우리의 실험실과 다른 사람들로부터 최근의 연구 나타냅니다 그각각의 세포 내 미토콘드리아는 다시 어머니와 딸 세포의 수명에 영향을 미치는 기능, 이기종입니다. ³ 따라서, 세포 내 해상도로 살아있는 세포의 미토콘드리아 ATP 수준과 산화 환원 상태를 측정 할 필요가있다.

모두 GFP를 기반으로하는 미토콘드리아 기능에 대한 바이오 센서는 여기에 설명. 산화 환원에 민감한 GFP (roGFP) ^{24,25 표면} 노출 시스테인이 분자에 추가되는 GFP의 변형입니다. roGFP는 야생 형 GFP와 같은 두 개의 여기 피크 (~ 400 nm의 ~ 480 nm의)와 ~ 510 nm에서 하나의 발광 피크가 있습니다. ~ 400 nm에서 여기에서 증가 roGFP 결과 시스테인의 산화. 그 시스테인의 감소는 ~ 480 nm의 여기를 하시 더군요. 따라서, 480 nm의 400 nm에서 roGFP의 흥분에 따라 510 nm의 방출의 비율은 형광 환경의 산화 환원 상태를 반영 감소 산화 roGFP의 상대적인 양을 보여준다.

두 적이roGFP의 이온이 널리 사용됩니다 roGFP1 및 roGFP2. 모두 동일한 시스테인 삽입이 포함되어 있습니다. roGFP1는 야생형 GFP 기반으로하고 roGFP2는 wtGFP ^24에 비해 400 nm에서 480 nm의 효율성이 여기에서 더 효율적 여기가 S65T GFP를 기반으로합니다. roGFP1는 roGFP2 및 동적 범위가 축소 된 범위로 더욱 확장보다 민감한 작은 산도있다. 따라서, roGFP1 더 감소와 같은 미토콘드리아로 구획 또는 세포질, 그리고 엔도 등의 변수 산도와 구획을 모니터링에 더 유용 할 수 있습니다. roGFP2은 밝은 신호, 일부 연구에서, roGFP1 ^24,26보다 더 큰 동적 범위를 제공합니다. 애기 장대의 연구는 산화 환원 상태의 변화에 대응하는 데 필요한 시간은 두 센서 (t ½ 산화, 65, 95 초와 T ½ 각각 roGFP1 및 roGFP2 감면, 272 및 206 초, 분)에 대해 유사한 것을 나타냅니다. ²⁶

MitGO-ATeam2은 최소로 침략적인, 믿을 수있다신진 효모 인 Saccharomyces cerevisiae의에 미토콘드리아 ATP를 측정하는 센서. GO-ATeam 기증자와 수용체 형광 단백질 (GFP와 오렌지 (OFP) 단백질의 형광, 각각) FRET F _O 사이에 F _1-ATP 합성 효소의 ε 소단위로 구성된 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 프로브. ²⁷ 를 가지고있는 단백질의 구조적 변화 ε 소단위 결과로 ATP의 결합은 수용체에 근접 기증자를 무서워하고 기증자의 수용체에 에너지 전달을 허용합니다. GO-ATeam, GO-ATeam1과 GO-ATeam2의 두 가지 변형이 있습니다. GO-ATeam2은 일반적으로 낮은 미토콘드리아에서 세포질에 비해 [ATP]. ^27를 측정하는 것이 더 적합하다, GO-ATeam1보다 MgATP에 대한 높은 친화력을 가지고

미토콘드리아의 산화 환원 상태를 조사하기 위해, 우리는 ATP9 리더 시퀀스 융합 roGFP1로 구성된 융합 단백질 (미토 roGFP1) 구축ND는 강한 글리 세르 알데히드 -3 – 인산 탈수소 효소 (GPD) 발기인 (p416GPD, Addgene)의 제어하에 플라스미드 중심체 기반 (낮은 사본 번호) 효모 식에 표현했다. 우리는 모델 곰팡이 사카 cerevisiae의 노화의 맥락에서 미토콘드리아의 산화 환원 상태를 조사하는 roGFP1를 사용했습니다. 우리는 roGFP1 노화 과정과 영양분 님의 질문에 답변 발생하지만, 효모 세포에 명백한 부정적인 영향을 미치지 않습니다 미토콘드리아의 산화 환원 상태의 변화를 감지 할 수있는 찾을 수 있습니다. 우리는 또한 개인 생활 효모 세포 내 미토콘드리아의 산화 환원 상태의 변화, 세포 내 공간 해상도를 가진 바이오 센서의 중요성을 강조 발견을 참조하십시오.

MitGO-ATeam2은 GO-ATeam2의 아미노 말단에 삽입 시토크롬 C 산화 효소의 소단위 VIIIA의 미토콘드리아 신호 순서가 GO-ATeam2의 변형입니다. ²⁷ 우리는 mitGO-ATeam2 프로브를 (친절 H.의 연구실에서 제공하는 수정 노지, 연구소 오F 과학 및 낮은 복사 플라스미드는 효모 발현 벡터 pAG415GPD-ccdB (Addgene, 캠브리지, MA, USA)에 Xba1 및 HindIII 사이트를 통해 그것을 서브 클로닝하여 효모에있는 사용을위한 산업 연구, 오사카 대학, 일본), 강한 제정 GPD 프로모터를 포함. 우리는 신진 효모 mitGO-ATeam2을 표현하고 미토콘드리아의 ATP 수준의 생리적 변화를 측정 할 수있는 효과적인 프로브 역할은 미토콘드리아에 독점적 지역화 DNA-결합 염료 DAPI, 함께 counterstaining하여 찾을 수 있습니다.

roGFP과 GO-ATeam은 유전자 인코딩됩니다 모두. 그 결과로, 그들은 도입 안정적으로 유지 그대로 세포 및 산화 환원 상태 나 개인, 살아있는 세포의 ATP 수준에 대한 정보를 제공 할 수 있습니다. 또한, 두 바이오 센서는 생리 학적 조건에서 산화 환원 상태 나 발생 ATP 수준의 변화를 모니터링합니다. ²⁸ 두 프로브도 비례합니다. 그 결과로,이 프로브로 만든 측정은 차에 의해 영향을받지 않습니다바이오 센서 농도​​ 또는 샘플의 조명이나 두께 nges. 마지막으로, 두 바이오 센서는 세포 내 공간 해상도를 제공합니다. 사실, roGFP은 미토콘드리아, ER을 대상으로하고 있으며, 엔도와 ²⁴ 퍼 옥시 솜, 그리고 pH를 거의 독립적으로 이러한 세포 소기관의 각각의 산화 환원 상태의 변화를 감지 할 수 있습니다.

Protocol

1. 바이오 센서와 효모 세포의 변화 리튬 아세테이트 방법 27을 사용하여 플라스미드 베어링 미토 roGFP 또는 mitGO-ATeam2하여 원하는 효모 균주를 변환 할 수 있습니다. 플라스미드 매개 바이오 센서와 변환을 확인하고 플라스미드의 손실을 방지하기 위해 선택하고 적절한 선택적 합성 완전 배지 (미토 roGFP을위한 SC-우라, 또는 mitGo-ATeam2을위한 SC-레우)에 형질 전환을 유지한다….

Representative Results

미토 roGFP와 미토콘드리아의 산화 환원 상태를 측정 여기, 우리는 미토 roGFP1 효모 세포의 성장 또는 미토콘드리아의 형태에 영향을주지 않고, 효모 살아있는 세포에서 감소하는 완전 산화에서 미토콘드리아의 산화 환원 상태의 변화를 감지하는 동적 범위를 가지고 것을 보여줍니다. 첫째, 우리는 미토콘드리아 대상 GFP 및 roGFP1을 표현하는 세포가 정상 요금 (그림 1A)에서<…

Discussion

여기, 우리는 효모 세포를 생활에 미토콘드리아 산화 환원 상태와 ATP 수준을 평가하기 위해 바이오 센서로 미토 roGFP1 및 mitGO – ATeam2를 사용하는 방법을 설명합니다. 우리는 양적 미토콘드리아의 형태 또는 배포 또는 세포 성장 속도에 대한 명백한 효과없이, 미토콘드리아에 표적의 플라스미드 매개 미토 roGFP1 또는 mitGO-ATeam 결과의 표현을 찾을 수 있습니다. ³ 미토 roGFP1 매우에서 미토콘드…

Materials

			Reagents
Antimycin A	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	1397-94-0	Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glycerol 0.05% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
Valap			Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
			Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides	Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)	3050	Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18×18 mm	Zeiss (Thornwood, NY)	474030-9000-000	These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)	12-545E	Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective	Nikon (Melville, NY)
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software	Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)
Volocity 3D Image Analysis software	Perkin Elmer (Waltham, MA)		Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ software	National Institutes of Health (Bethesda, MD)		http://rsb.info.nih.gov/ij/