成比例的生物传感器测量活酵母细胞中的线粒体氧化还原状态和ATP

Summary

我们描述了使用两个比例，基因编码生物传感器的，这是基于GFP，监测线粒体的氧化还原状态和细胞内ATP水平分辨率在活酵母细胞。

Abstract

线粒体有许多细胞过程中的角色，从能量代谢和钙稳态控制细胞的寿命和程序性细胞死亡。这些过程的影响和受氧化还原状态和线粒体ATP生产。在这里，我们描述了使用两个比例，基因编码生物传感器的活酵母细胞可以检测线粒体氧化还原状态和ATP的水平，在亚细胞分辨率。线粒体氧化还原状态是​​用氧化还原敏感绿色荧光蛋白（roGFP）的线粒体基质中，有针对性地计量。水户roGFP包含半胱氨酸残基的位置147和204的GFP，经历可逆的，依赖于环境的氧化和还原反应，这反过来又改变的蛋白质的激发光谱。 MitGO ATEAM是一个福斯特共振能量转移（FRET）探针，其中_F o的ε亚基的F _1-ATP合酶被夹持在FRET的供体和受体荧光蛋白rescent。 ATPε亚基中的蛋白质构象变化带来的结果结合FRET供体和受体在接近并允许从捐赠者到受体荧光共振能量转移。

Introduction

线粒体ATP的产生，氨基酸，脂肪酸，血红素，铁硫簇和嘧啶的生物合成的细胞器是必不可少的。线粒体发挥钙稳态的关键角色，并在细胞凋亡的调控^。1增加的证据链接线粒体老化和与年龄有关的疾病，包括帕金森氏症，阿尔茨海默氏病，肌萎缩性侧索硬化症，亨廷顿氏病^。2虽然个人住他们的整个生活与神经退行性疾病都与线粒体蛋白质的突变，这种疾病的症状只出现在以后的生活。这表明发生变化，随着年龄的增长，使疾病的病理出现线粒体。事实上，与整体细胞的健康和寿命在酵母和哺乳动物细胞线粒体健身^3,4在这里，我们介绍了如何使用基因编码的荧光生物传感器，比例来评估两个关键功能mitoc活酵母细胞hondria：氧化还原状态和ATP水平。

线粒体功能的有氧能量动员是公认的。线粒体的氧化还原状态的物种减少和氧化的细胞器，包括NAD ⁺ / NADH，FAD / FADH _2，NADP ⁺ / NADPH，谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH / GSSG）和活性氧（ROS）的产物。线粒体解偶联或缺氧影响线粒体呼吸活动，改变比例的NAD ⁺ NADH在细胞器。活性氧，所生产，从低效内线粒体膜的电子传递链的复合物，以及胺的脱氨作用，通过线粒体外膜的单胺氧化酶的^5星 ，损害脂质，蛋白质和核酸之间的电子转移，并有被认为与老化和年龄相关的神经退行性疾病^6,7,8。 ROS信号转导中也发挥了作用，在mitochondria，通过氧化作用的谷胱甘肽。例如，NADH脱氢酶不仅有利于活性氧的产生，但也调节通过与谷胱甘肽池^9,10相互作用。 α-酮戊二酸脱氢酶，乌头酸，TCA循环的组成部分，展览活动减少，在氧化环境^11,12。

事实上，乌头酸活性的氧化还原依赖调节是保守的，从细菌到哺乳动物^13,14。因此，监测的氧化还原状态和线粒体ATP水平是至关重要的，以了解它们的功能和作用，在疾病的病理。

生化的方法已被用来评估整个细胞的氧化还原状态或ATP水平或分离的线粒体。广泛使用的方法，以评估氧 ​​化还原状态的全细胞或分离线粒体基于测量的氧化还原对的GSH / GSSG ^15的水平。荧光素 – 荧光素酶系统通常用于测量线粒体在任一透整个细胞或分离线粒体的ATP水平^{。16,17,18,19,20}在该试验中，荧光素酶的ATP结合和催化从荧光素的氧化和化学发光^。21所发出的光的强度的量成比例在反应混合物中的ATP ²²

这些方法已揭示的基本信息，对线粒体的功能，包括发现，神经变性疾病，如阿尔茨海默氏病，患者具有异常低的ATP水平^。[23]然而，它们不能被用于图像的生活，完整的细胞。此外，全细胞分析方法的基础上提供了在所有车厢的细胞的氧化还原状态或ATP水平平均。在孤立的细胞器是测量潜在的问题，因为在亚细胞分离线粒体氧化还原状态或ATP水平可能会改变。最后，从我们的实验室和其他最近的研究表明，异构单个细胞内线粒体的功能，这反过来又影响母亲和女儿细胞的寿命。 ^因此 ，有必要在活细胞与亚细胞分辨率来衡量线粒体ATP水平和氧化还原状态。

这里描述的线粒体功能的生物传感器都是基于GFP。氧化还原敏感的^{GFP（roGFP）24,25}的表面暴露的半胱氨酸被添加到该分子的GFP变异体。 roGFP，像野生型GFP，有两个激发峰（〜400纳米〜480纳米）和1〜510 nm的发射峰。在roGFP〜400 nm的激发波长的增加导致氧化的半胱氨酸残基。这些半胱氨酸的减少有利于激发〜480纳米。因此，比例为510 nm发射峰在480nm和400 nm的激发roGFP时揭示的相对量减少，氧化roGFP的，这反映了荧光基团的氧化还原状态的环境。

两个自愿减排量离子roGFP广泛应用于：roGFP1 roGFP2。两者都包含相同的半胱氨酸插入。是根据roGFP1野生型GFP roGFP2的是根据S65T的GFP，它具有更有效的激励wtGFP ²⁴相比，在480nm和在400nm处的激发效率较低。 roGFP1 pH敏感比roGFP2，其动态范围进一步扩展到范围减小。因此，roGFP1可能是更有益的监测更减少车厢如线粒体或胞液中，并具有可变的pH值，如内涵体的隔间。 roGFP2提供明亮的信号，并在一些研究中，动态范围更大比roGFP1 ^24,26。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）的研究表明，类似的两个传感器（吨半氧化，65和95秒和吨半减少，272和206秒，roGFP1和roGFP2，分别）的氧化还原状态的变化所需的时间^。26

是一种微创，可靠MitGO ATeam2传感器，用来测量在萌芽酿酒酵母线粒体ATP。 GO-ATEAM的一个福斯特共振能量转移（FRET）探针，由ε亚基的_F o的F _1-ATP合酶之间夹着²⁷ FRET的供体和受体荧光蛋白（GFP和橙色荧光蛋白（OFP）的，分别）。的ATP结合ε亚基蛋白质的构象变化，带来的结果FRET的供体受体靠近，并允许从供体到受体的能量转移。有两个变种GO-ATEAM的，GO-ATeam1和GO-ATeam2的。 GO-ATeam2具有较高的亲和力MgATP GO-ATeam1相比的，使其更适合用于测量通常较低^[27]在线粒体中ATP的细胞质。

为了探讨线粒体氧化还原状态，我们构建了融合蛋白（美图roGFP1）由roGFP1，融合到线粒体前导序列一ND表示从着丝粒为主（低拷贝数）控制下的强烈甘油醛-3 – 磷酸脱氢酶（GPD）的子（p416GPD Addgene）酵母表达质粒。我们使用roGFP1老化模型真菌酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的上下文中，以探测线粒体氧化还原状态。我们发现，roGFP1可以检测线粒体氧化还原状态的变化过程中发生的老化和营养可用的，但没有明显的不利的影响酵母细胞。我们也看到个别活酵母细胞内线粒体的氧化还原状态的变化，这一发现强调了重要性的生物传感器与亚细胞空间分辨率。

MitGO ATeam2的一个变种GO ATeam2，其中有在氨基端的GO-ATeam2的线粒体信号序列插入细胞色素c氧化酶亚基VIIIA ²⁷我们修改了mitGO ATeam2的探头（请提供实验室H.野地研究所Øf科学和工业研究，大阪大学，日本）使用亚克隆酵母，通过Xba1和HindⅢ网站，进入酵母表达载体pAG415GPD的CCDB（Addgene，剑桥，MA，USA），这是一个低拷贝质粒含有强组成GPD启动子。我们在芽殖酵母表达mitGO ATeam2，并发现，通过复染的DNA结合染料DAPI，它完全定位到线粒体，它作为一个有效的探针测量生理变化线粒体ATP水平。

roGFP和GO-ATEAM的基因编码。其结果是，它们可以被引入，并稳定地保持在完整的细胞中，并提供个人，活细胞的氧化还原状态或ATP水平的信息。此外，这两种生物传感器监测在生理条件下发生的氧化还原状态或ATP水平的变化，也是比例²⁸两种探头。其结果是，与这些探针的测量不会受到茶生物传感器浓度或样品照明或厚度的民营企业。最后，无论是生物传感器提供的亚细胞空间分辨率。事实上，已针对roGFP线粒体，ER，内涵体和过氧化物酶体^24，而且可以检测到这些细胞器的氧化还原状态的变化，基本上与pH值无关。

Protocol

1。酵母细胞转化与生物传感器变换所需的酵母菌株质粒轴承的线粒体roGFP或mitGO ATeam2使用醋酸锂方法27。 要确认改造质粒传播的生物传感器和防止质粒亏损，选择，并保持适当的选择性合成完全培养基（SC-市建局线粒体roGFP，或SC-列伊为mitGo ATeam2的）转化。如果已经比这里所描述的不同的质粒中亚克隆的荧光探针，使用适当的选择性培养基。通过荧光显微镜确认，他们表达?…

Representative Results

测量线粒体氧化还原状态与线粒体roGFP 在这里，我们表明，线粒体roGFP1的动态范围来检测线粒体氧化还原状态的变化，从完全氧化在活酵母细胞减少，而不会影响酵母细胞的生长或线粒体的形态。首先，我们发现，细胞线粒体有针对性的GFP和roGFP1的增长，正常率（ 图1A）。最大生长速率，最大坡度为日志相生长期间生长曲线和时间达到最大生长速率，是类似表达线?…

Discussion

在这里，我们介绍使用方法线粒体roGFP1 mitGO ATeam2的生物传感器在活酵母细胞线粒体的氧化还原状态和ATP水平评估。我们发现，表达的质粒量化目标线粒体，线粒体的形态和分布或细胞生长率没有任何明显的影响的的传染的的线粒体roGFP1或mitGO ATEAM结果^。3美图roGFP1的检测线粒体氧化还原状态的变化，从高氧化，高度降低的状态。同样，mitGO ATEAM可以测量发生呼吸抑制剂治疗呼吸驱动增长和?…

Materials

			Reagents
Antimycin A	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	1397-94-0	Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glycerol 0.05% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
Valap			Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
			Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides	Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)	3050	Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18×18 mm	Zeiss (Thornwood, NY)	474030-9000-000	These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)	12-545E	Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective	Nikon (Melville, NY)
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software	Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)
Volocity 3D Image Analysis software	Perkin Elmer (Waltham, MA)		Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ software	National Institutes of Health (Bethesda, MD)		http://rsb.info.nih.gov/ij/