Biosensori MIL Tale misura mitocondriale stato redox e ATP in cellule viventi di lievito

Summary

Descriviamo l'uso di due raziometrici, biosensori geneticamente codificati, che si basano sulla GFP, per monitorare lo stato redox mitocondriale e livelli di ATP a risoluzione subcellulare in vita cellule di lievito.

Abstract

I mitocondri hanno ruoli in molti processi cellulari, dal metabolismo energetico e l'omeostasi del calcio per controllare di vita cellulare e morte cellulare programmata. Questi processi influenzano e sono influenzate dallo stato redox e della produzione di ATP dai mitocondri. Qui, descriviamo l'uso di due raziometrici, biosensori geneticamente codificati che possono rilevare mitocondriale stato redox e livelli di ATP a risoluzione sub-cellulare in cellule di lievito vive. Stato redox mitocondriale è misurata utilizzando redox-sensibili proteina fluorescente verde (roGFP), che si rivolge alla matrice mitocondriale. Mito-roGFP contiene cisteine ​​nelle posizioni 147 e 204 della GFP, che subiscono ossidazione e riduzione reversibile e ambiente-dipendente, che a sua volta altera lo spettro di eccitazione della proteina. MitGO-Ateam è un trasferimento di energia di risonanza Förster (FRET) sonda in cui la subunità ε della F _o F _1-ATP sintasi è inserita tra FRET donatore e accettore fluoproteine ​​centi. Legame di ATP ai risultati subunità ε nei cambiamenti conformazionali nella proteina che portano il donatore e accettore FRET in stretta vicinanza e per consentire il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza dal donatore al accettore.

Introduction

I mitocondri sono organelli essenziali per la produzione di ATP, la biosintesi di aminoacidi, acidi grassi, ferro eme, ammassi di zolfo e pirimidine. I mitocondri svolgono anche un ruolo fondamentale nell'omeostasi del calcio e nella regolazione dell'apoptosi. ¹ crescenti prove link mitocondri di invecchiamento e malattie legate all'età come il morbo di Parkinson, morbo di Alzheimer, la sclerosi laterale amiotrofica, e la malattia di Huntington. ² Mentre gli individui vivono tutta la loro vita con mutazioni nelle proteine ​​mitocondriali che sono associate con malattie neurodegenerative, i sintomi della malattia si verificano solo tardi nella vita. Questo indica che i cambiamenti avvengono nei mitocondri con l'età che permettono malattia patologia ad emergere. Infatti, fitness mitocondriale è correlata con la salute generale delle cellule e la durata della vita nei lieviti e cellule di mammifero. ^3,4 Qui, descriviamo come utilizzare biosensori fluorescenti geneticamente codificati, raziometriche per valutare due aspetti critici della Mitochondria in cellule di lievito vive: stato redox e livelli di ATP.

Funzione mitocondriale in aerobico mobilitazione energia è ben stabilita. Stato redox mitocondriale è un prodotto di ossidanti e riducenti specie nel organello, compresi NAD ⁺ / NADH, FAD / FADH _2, NADP ⁺ / NADPH, glutatione / glutatione disolfuro (GSH / GSSG) e specie reattive dell'ossigeno (ROS). Sganciamento mitocondri o ipossia interessa l'attività respiratoria mitocondriale e altera il rapporto di NAD ⁺ in NADH in organello. ROS, che sono prodotte dal trasferimento di elettroni inefficiente tra i complessi della catena di trasporto degli elettroni nella membrana mitocondriale interna, così come dalla deaminazione di amine tramite monoamino-ossidasi nella membrana mitocondriale esterna ^5, lipidi danni, proteine ​​e acidi nucleici e hanno stato collegato a invecchiamento e le malattie neurodegenerative associate all'età ^6,7,8. ROS anche svolgere un ruolo nella trasduzione del segnale in mitochondria, attraverso l'ossidazione di GSH. Ad esempio, NADH deidrogenasi contribuisce non solo alla produzione di ROS, ma anche è regolata attraverso le interazioni con il pool di glutatione ^9,10. deidrogenasi α-chetoglutarato e aconitasi, componenti del ciclo TCA, mostrano un'attività ridotta in ambienti ossidanti ^11,12.

Infatti, regolazione redox-dipendente di attività aconitasi è conservato dai batteri ai mammiferi ^13,14. Pertanto, il monitoraggio dello stato redox e livelli di ATP di mitocondri è fondamentale per capire la loro funzione e il ruolo nella malattia di patologia.

Metodi biochimici sono stati utilizzati per valutare lo stato redox o livelli di ATP di cellule intere o mitocondri isolati. I metodi utilizzati per valutare lo stato redox delle cellule intere o mitocondri isolati si basano sulla misurazione dei livelli della coppia redox GSH / GSSG ^15. Il sistema luciferina-luciferasi viene comunemente utilizzato per misurare mitocondrialeLivelli di ATP nelle cellule intere sia permeabilizzate o mitocondri isolati. ^{16,17,18,19,20} In questo saggio, luciferasi lega alla ATP e catalizza l'ossidazione di chemiluminescenza e dalla luciferina. ²¹ L'intensità della luce emessa è proporzionale alla quantità di ATP nella miscela di reazione. ²²

Questi metodi hanno rivelato informazioni fondamentali riguardanti la funzione mitocondriale, tra cui la constatazione che i pazienti con malattie neurodegenerative, come il morbo di Alzheimer, hanno livelli anormalmente bassi di ATP. ²³ Tuttavia, essi non possono essere usati a vivere immagine, cellule intatte. Inoltre, metodi basati su analisi a cellule forniscono una media di stato redox o livelli di ATP in tutti i compartimenti della cellula. Misure in organelli isolati sono potenzialmente problematico perché mitocondriale stato redox o livelli di ATP possono cambiare durante il frazionamento subcellulare. Infine, recenti studi del nostro laboratorio e altri indicano chemitocondri all'interno delle singole celle sono eterogenei in funzione, che a sua volta influenza la durata della vita delle cellule madre e figlia. ³ Quindi, vi è la necessità di misurare i livelli di ATP mitocondriale e lo stato redox nelle cellule viventi con risoluzione sub-cellulare.

I biosensori per la funzione mitocondriale descritti qui sono entrambi basati su GFP. GFP redox-sensibile (roGFP) ^24,25 è una variante di GFP in cui superficie esposti cisteine ​​vengono aggiunti alla molecola. roGFP, come wild-type GFP, ha due picchi di eccitazione (a ~ 400 nm e 480 nm ~) e un picco di emissione a ~ 510 nm. Ossidazione dei residui di cisteina nei risultati roGFP in un aumento di eccitazione a 400 nm. Riduzione di quei cisteine ​​favorisce eccitazione a ~ 480 nm. Perciò, il rapporto di 510 nm di emissione di roGFP upon eccitazione a 480 nm e 400 nm rivela la quantità relativa di ridotta e ossidata roGFP, che riflette lo stato redox dell'ambiente del fluoroforo.

Due versioni di roGFP sono ampiamente utilizzati: roGFP1 e roGFP2. Entrambi contengono gli stessi inserimenti cisteina. roGFP1 è basato sulla GFP wild-type e roGFP2 si basa su S65T GFP, che ha più efficiente eccitazione a 480 nm e meno efficiente eccitazione a 400 nm rispetto al wtGFP ^24. roGFP1 pH è meno sensibile rispetto roGFP2 e la sua gamma dinamica prosegue nel range ridotto. Così, roGFP1 può essere più utile per monitorare comparti più riducenti come i mitocondri e il citosol, e scomparti con pH variabile, come endosomi. roGFP2 offre segnale luminoso e, in alcuni studi, una più ampia gamma dinamica rispetto roGFP1 ^24,26. Studi in Arabidopsis thaliana indicano che il tempo necessario per rispondere alle variazioni di stato redox è simile per entrambi i sensori (t ½ per l'ossidazione, 65 e 95 sec e t ½ per la riduzione, 272 e 206 sec, per roGFP1 e roGFP2, rispettivamente). ²⁶

MitGO-ATeam2 è un mini-invasiva, affidabilesensore che misura ATP mitocondriale nella nascente lievito Saccharomyces cerevisiae. GO-Ateam è un trasferimento di energia di risonanza Förster (FRET) sonda che consiste della subunità ε della F _o F _1-ATP sintasi FRET sandwich tra donatore e accettore proteine ​​fluorescenti (GFP e arancio proteina fluorescente (OFP), rispettivamente). ²⁷ legame di ATP ai risultati subunità ε nei cambiamenti conformazionali nella proteina che portano il FRET donatore in prossimità del accettore e il trasferimento di energia dal donatore accettore. Ci sono due varianti di GO-Ateam, GO-ATeam1 e GO-ATeam2. GO-ATeam2 ha una maggiore affinità per MgATP rispetto GO-ATeam1, rendendolo più adatto per misurare l'tipicamente inferiore [ATP] nei mitocondri rispetto al citosol. ²⁷

Per sondare stato redox mitocondriale, abbiamo costruito una proteina di fusione (mito-roGFP1) costituito roGFP1 fusa alla sequenza leader di un ATP9nd espressa da un'espressione lievito centromero-based (basso numero di copie) plasmide sotto controllo del forte deidrogenasi gliceraldeide-3-fosfato (GPD) promotore (p416GPD, Addgene). Abbiamo usato roGFP1 per sondare lo stato redox dei mitocondri nel contesto di invecchiamento del modello fungo Saccharomyces cerevisiae. Troviamo che roGFP1 in grado di rilevare variazioni di stato redox mitocondriale che si verificano durante l'invecchiamento e in risposta alla disponibilità di nutrienti, ma non ha alcun effetto negativo sulla apparente cellule di lievito. Vediamo anche la variabilità dello stato redox dei mitocondri all'interno delle singole cellule di lievito viventi, un risultato che sottolinea l'importanza di un biosensore con subcellulare risoluzione spaziale.

MitGO-ATeam2 è una variante del GO-ATeam2, che ha la sequenza segnale mitocondriale di citocromo c ossidasi subunità VIII inserito al terminale amminico di GO-ATeam2 ^27. Abbiamo modificato la sonda mitGO-ATeam2 (gentilmente fornite dal laboratorio di H. Noji, Istituto of Ricerca Scientifica e Industriale, Università di Osaka, Giappone) per l'uso nel lievito da subclonaggio esso, tramite Xba1 e siti HindIII, nel vettore di espressione di lievito pAG415GPD-CCDB (Addgene, Cambridge, MA, USA), che è un low-copia plasmide contenente il promotore costitutivo forte GPD. Abbiamo espresso mitGO-ATeam2 in lievito in erba, e troviamo, dalla controcolorazione con il colorante DAPI legame al DNA, che si localizza esclusivamente ai mitocondri, dove serve come una sonda efficace per misurare i cambiamenti fisiologici nei livelli di ATP mitocondriale.

roGFP e GO-Ateam sono entrambi geneticamente codificati. Come risultato, essi possono essere introdotti e mantenuti stabilmente in cellule intatte, e forniscono informazioni su stato redox o livelli di ATP in singole, cellule viventi. Inoltre, entrambi i biosensori monitorare i cambiamenti di stato redox o livelli di ATP che si verificano in condizioni fisiologiche. ²⁸ Entrambe le sonde sono anche ratiometrica. Come risultato, le misurazioni effettuate con queste sonde non risentono chaNGES nella concentrazione biosensore o l'illuminazione del campione o spessore. Infine, entrambi i biosensori forniscono subcellulare risoluzione spaziale. Infatti, roGFP è stato preso di mira da mitocondri, ER, endosomi e perossisomi ^24, e in grado di rilevare i cambiamenti di stato redox di ciascuno di questi organelli, in gran parte indipendenti di pH.

Protocol

1. Trasformazione di cellule di lievito con i biosensori Trasforma il ceppo di lievito desiderato con cuscinetto plasmide mito-roGFP o mitGO-ATeam2 con il metodo acetato di litio 27. Per confermare la trasformazione con il biosensore plasmide-borne e per evitare la perdita del plasmide, selezionare e mantenere trasformanti sul appropriato terreno selettivo completo sintetico (SC-Ura di mito-roGFP, o SC-Leu per mitGo-ATeam2). Se la sonda fluorescente è stato subclonato in un plasmide dive…

Representative Results

Misurare stato redox mitocondriale con mito-roGFP Qui, dimostriamo che mito-roGFP1 ha la gamma dinamica per rilevare cambiamenti di stato redox mitocondriale da completamente ossidato a ridotto in cellule di lievito vive, senza influenzare la crescita delle cellule di lievito o la morfologia mitocondriale. In primo luogo, troviamo cellule che esprimono GFP mitocondri mirati e roGFP1 crescono a ritmi normali (Figura 1A). Il tasso di crescita massimo, misurato dalla massima pende…

Discussion

Qui, descriviamo i metodi da utilizzare mito-roGFP1 e mitGO-ATeam2 come biosensori per valutare mitocondriale stato redox e livelli di ATP in cellule di lievito vive. Troviamo che l'espressione del plasmide-borne mito-roGFP1 o mitGO-Ateam risultati in quantitativa mira a mitocondri, senza alcun effetto evidente sulla morfologia o la distribuzione mitocondriale o sui tassi di crescita cellulari. ³ Mito-roGFP1 in grado di rilevare variazioni di stato redox mitocondriale da molto ossidato a stati fortemente …

Materials

			Reagents
Antimycin A	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	1397-94-0	Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glycerol 0.05% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
Valap			Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
			Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides	Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)	3050	Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18×18 mm	Zeiss (Thornwood, NY)	474030-9000-000	These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)	12-545E	Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective	Nikon (Melville, NY)
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software	Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)
Volocity 3D Image Analysis software	Perkin Elmer (Waltham, MA)		Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ software	National Institutes of Health (Bethesda, MD)		http://rsb.info.nih.gov/ij/