本文介绍了用于生产从大鼠小肠脱细胞基质的方法。肠道支架的推导是重要的组织工程未来的应用,干细胞生物学和药物测试。
成功的组织工程支架包括与适当的细胞在体外或在体内的结合。支架可以是合成的,天然衍生的或从组织/器官中得到。后者使用的是所谓的脱细胞技术来获得。脱细胞可能涉及的物理,化学和酶相结合的方法。该技术的目标是消除所有蜂窝痕迹,同时保持原始组织的宏观和微观结构。
肠组织工程迄今已使用相对简单的支架不复制原生器官的复杂结构。本文的重点是描述对大鼠小肠一种有效的脱细胞技术。小肠的隔离,以保证血管连接的维护进行说明。化学和酶溶液的组合,以除去细胞whilST保留绒毛隐窝轴支架的管腔方面亦载。最后,制作支架的相应特性的评估进行了讨论。
组织工程(TE)提供了一个治疗选择器官移植,绕过免疫抑制和器官短缺的问题。 TE最近有在临床的成功应用,具有替代器官,如膀胱1,尿道口2和气管,无论是在3,4成人和儿童5。
构建组织工程化器官需要一个支架与适当的细胞相结合。甲支架可以使用天然来源的( 如胶原蛋白)进行制备和合成的( 例如,聚-L-羟基乙酸; PLGA)的材料,或由天然器官和组织的脱细胞来获得。已经使用的迄今为肠TE支架主要被任一脱细胞(小肠粘膜下层)或合成的(聚-L-羟基乙酸和聚乳酸)6-13。这些生物材料是很简单的在宏观和微观架构,可能不是很理想,如果组织工程小肠被临床换算。对于肠道的最佳生物材料应具有一种天生的血管树,可连接到主机的血液供应,分层管状壁具有不同的属性,以反映对肠壁的各层和绒毛隐窝轴线上的腔侧,以帮助用再增殖上皮干细胞。
脱细胞是从整个器官取出细胞,同时保持其原有的建筑14棚架产生了一种新的方法。这是优选的,以现有的支架,因为它们不仅复制该器官的结构,而且包含嵌入的细胞外基质(ECM),该辅助细胞的增殖和分化中的化学信号。在2008年一个尸体气管脱细胞14,播种与患者自身的细胞,并移植到更换主力左支气管的年轻人<sup> 3。从那时起,一些团体已经报道的生产脱细胞支架在小型和大型动物的心脏15,16,17肝和肺18-20。
我们还适于相同的方法,以产生一个小肠粘膜脱细胞的支架21。本文所描述的方法的目的是产生一个保持原有的组织,例如血液供应,以及绒毛隐窝轴在肠腔内的微观结构的宏观特征脱细胞的肠矩阵。我们相信,这种方法可能最终会采用其他器官,以提高脱细胞的效率。
设立这个实验最困难的步骤涉及SMA的插管,并建立和维持无菌的。 Cannulating在SMA在啮齿类动物中而不破裂的壁可以是由于容器的尺寸和位置相当困难的。可选地,缝合线可被置于围绕所述近端主动脉前向SMA原点,其次是主动脉本身远侧插管,指挥塑料插管插入SMA。在脱细胞可怜的导管放置和高流速的组合可能导致丢失的血管通路。不育是由于存在于小肠菌群的数量的一个重大问题。以下收获用PBS洗涤/ AA是非常重要的,并且排泄物或碎屑的任何迹象,必须从腔中移除。在falcon管中,用DMEM将所述支架的一部分在孵化以下紫外线消毒应是一个指标,如果不育已经实现。在该情况下,细菌定植,媒体将改变pH值与来自红的颜色转向黄色。为了解决这个问题,进一步紫外线周期,建议,以及用PBS洗涤含有高浓度的抗生素/抗真菌的。
一个可能的修改以获得既血管和静脉通路支架是将导管插入下腔静脉(IVC),以及对SMA。从静脉血管两侧脱细胞应间歇地尝试所有三种解决方案。连续脱细胞可以由具有在两侧的正压力脉冲串的毛细血管。
多年来已经出现了许多体外和体内 6,9,12使用不同的细胞支架材料的组合在肠TE努力。大部分工作已经使用涂有胶原蛋白I型6,7,13,22管状非织造布95%的PGA-5%PLGA支架进行。下面播种肠上皮组织体单位(OU),并在一段植入到小鼠的网膜时,它们形成囊肿肌肉上,然后可以卷管内侧到外侧和上皮。然而,在这些支架的设计的孔隙率和简洁不允许用于在体外环境中,例如,一个生物反应器中的大颗人造肠的产生。此外,由于缺乏可连接到接收方的进一步的先天血管网的限制使用这种支架的临床平移。除了与PGA-PLGA支架的实验中,其它基团所用的胶原蛋白或SIS的支架,这两者不复制肠道的复杂性。 SIS尤其是肠组织工程的唯一一次公布的方法,并已应用于150多个医疗环境,展示脱细胞支架,以提供机械稳定性和促进细胞生长,而铅的能力ing到无免疫原性反应。然而,由于缺乏适当的宏观和微架构,导致了其“用于肠道TE的目的9-11,23效果差。
的脱细胞的方法,我们已经描述的优点包括微观特征,如管腔隐窝 – 绒毛体系结构表示为复育适当的环境中被肠干细胞小生境的保存。在宏观方面,一种分级的血管网的存在下,使附着到接收者,从而提供营养和氧气到TE-肠管21的所有层。更重要的是,细胞外基质组分如胶原,弹性蛋白和glyocosaminoglycans的维护不仅对机械特性,而且还指示细胞增殖和分化中起重要作用。最重要的是,脱细胞的方法的能力被放大到大Ř组织,同时保持相同的特性是用于TE的临床翻译的重要特征。
天然肠基质用血管网络的发展允许创建较大的人造肠,可连接到主机的段。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢再生医学的维克森林大学的帮助与此协议的开发。我们从大奥蒙德街医院慈善助学金承认的支持,该基金会欧亨尼奥Litta的(瑞士日内瓦),医学研究理事会,英国皇家外科医学院英格兰,火花儿童医疗慈善机构,英国外交部对英国/美国干细胞协同合作奖和米塔尔研究基金。我们还要感谢英国皇家学会/沃尔夫森基金会在儿童健康研究所获得的小儿外科组织工程实验室整修补助金。 PDC和东南由大奥蒙德街医院儿童慈善活动的支持。
Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
Ethanol solution, 70% in H20 | Sigma | 02877 | |
Phosphate buffered saline tablets | Sigma | 79382 | |
Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma | A5955 | |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | Oral and eye irritant; use protection |
Sodium chloride | |||
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 |