एक प्राकृतिक अकोशिकीय आंतों मैट्रिक्स के उत्पादन के लिए Decellularization क्रियाविधि
Summary
लेख चूहा आंत से एक अकोशिकीय मैट्रिक्स के उत्पादन के लिए एक कार्यप्रणाली का वर्णन करता है. आंतों scaffolds की व्युत्पत्ति कोशिका जीव विज्ञान और औषधि परीक्षण स्टेम, ऊतक इंजीनियरिंग में भविष्य अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है.
Abstract
सफल ऊतक इंजीनियरिंग इन विट्रो में या विवो में उपयुक्त कोशिकाओं के साथ scaffolds के संयोजन शामिल है. Scaffolds, सिंथेटिक स्वाभाविक रूप से व्युत्पन्न या ऊतकों / अंगों से प्राप्त किया जा सकता है. उत्तरार्द्ध decellularization नामक तकनीक का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं. Decellularization भौतिक, रासायनिक, और एंजाइमी तरीकों का एक संयोजन शामिल हो सकता है. इस तकनीक का लक्ष्य मूल ऊतक के स्थूल और सूक्ष्म वास्तुकला बनाए रखने whilst सभी सेलुलर निशान को दूर करने के लिए है.
आंतों के ऊतकों इंजीनियरिंग प्रकार अब तक देशी अंग की जटिल वास्तुकला को दोहराने नहीं है कि अपेक्षाकृत सरल scaffolds इस्तेमाल किया गया है. इस पत्र का ध्यान केंद्रित चूहा छोटी आंत के लिए एक कुशल decellularization तकनीक का वर्णन करने के लिए है. छोटी आंत के अलगाव एक संवहनी कनेक्शन के रखरखाव सुनिश्चित करने के लिए इतनी के रूप में वर्णन किया गया है. whil कोशिकाओं को दूर करने के लिए रासायनिक और एंजाइमी समाधान के संयोजनपाड़ की luminal पहलू में अंकुर-तहखाना अक्ष संरक्षण सेंट भी बाहर सेट है. अंत में, उपयुक्त विशेषताओं के लिए उत्पादन scaffolds के मूल्यांकन पर चर्चा की है.
Introduction
टिशू इंजीनियरिंग (ते) प्रतिरक्षादमन और अंग की कमी के मुद्दों को दरकिनार, अंग प्रत्यारोपण के लिए एक चिकित्सकीय विकल्प प्रदान करता है. ते हाल ही में इस तरह के वयस्कों 3,4 और बच्चों को 5 में दोनों मूत्राशय 1, मूत्रमार्ग 2 और श्वासनली, जैसे अंगों के प्रतिस्थापन के साथ, क्लिनिक में सफल अनुप्रयोगों पड़ा है.
एक ऊतक इंजीनियर अंग बिल्डिंग उपयुक्त कोशिकाओं के साथ एक चबूतरा का संयोजन जरूरी है. एक पाड़ स्वाभाविक रूप से व्युत्पन्न (जैसे कोलेजन) का उपयोग कर तैयार है और सिंथेटिक (जैसे पाली एल एसिड, PLGA) किया जा सकता सामग्री, या देशी अंगों और ऊतकों की decellularization द्वारा प्राप्त किया जा. आंतों ते के लिए इस प्रकार अब तक इस्तेमाल किया गया है कि scaffolds मुख्य रूप से 6-13 (पाली एल एसिड और पाली लैक्टिक एसिड) decellularized (छोटे आंतों submucosa) या कृत्रिम या तो कर दिया गया है. इन biomaterials, स्थूल और सूक्ष्म वास्तुकला दोनों में बहुत सरल हैं जोऊतक इंजीनियर आंत चिकित्सकीय अनुवाद किया जाना है, तो आदर्श नहीं हो सकता. आंत के लिए एक इष्टतम biomaterial के साथ सहायता luminal ओर मेजबान के रक्त की आपूर्ति, आंतों की दीवारों की परतों को प्रतिबिंबित करने के लिए विभिन्न गुणों के साथ एक tiered ट्यूबलर दीवार और एक अंकुर-तहखाना धुरी से जोड़ा जा सकता है कि एक जन्मजात संवहनी पेड़ होनी चाहिए उपकला स्टेम कोशिकाओं से repopulation.
Decellularization उनके मूल वास्तुकला 14 बनाए रखने के पूरे अंगों से कोशिकाओं को निकाल कर scaffolds उत्पादन एक उपन्यास पद्धति है. यह वे अंग की संरचना को दोहराने लेकिन यह भी बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) कि सहायता सेलुलर प्रसार और भेदभाव के भीतर एम्बेडेड रासायनिक संकेत होते ही नहीं, क्योंकि पहले से ही scaffolds मौजूदा करने के लिए बेहतर है. 2008 में एक शव का श्वासनली मरीज की अपनी कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त, 14 decellularized, और एक युवक में मुख्य बाईं श्वसनी बदलने के लिए प्रत्यारोपित किया गया था <sup> 3. तब से, समूहों की एक संख्या में छोटे और बड़े जानवरों में दिल 15, जिगर 16,17, और फेफड़ों 18-20 के लिए decellularized scaffolds के उत्पादन की सूचना दी है.
हम भी एक छोटी आंतों decellularized पाड़ 21 निर्माण करने के लिए एक ही पद्धति को ढाल लिया है. इस के साथ साथ वर्णित विधि के लक्ष्य को इस तरह के रक्त की आपूर्ति के रूप में मूल ऊतक, साथ ही आंतों लुमेन में अंकुर-तहखाना अक्ष के सूक्ष्म वास्तुकला के macroscopic विशेषताओं को बनाए रखने कि decellularized आंतों matrices का उत्पादन होता है. हम इस पद्धति अंततः decellularization की दक्षता में सुधार करने के लिए अन्य अंगों के लिए अपनाया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रयोग की स्थापना में सबसे कठिन कदम SMA के केन्युलेशन और स्थापना और बाँझपन का रखरखाव शामिल है. दीवार rupturing बिना कृन्तकों में SMA Cannulating कारण जहाज के आकार और स्थिति के लिए काफी मुश्किल हो सकता है. वैकल्पिक रूप से, एक सीवन SMA में प्लास्टिक प्रवेशनी निर्देशन, distally महाधमनी खुद की केन्युलेशन, जिसके बाद पूर्व SMA मूल के समीपस्थ महाधमनी के आसपास रखा जा सकता है. Decellularization दौरान गरीब प्रवेशनी प्लेसमेंट और उच्च प्रवाह दरों का एक संयोजन नाड़ी का उपयोग खोने में परिणाम हो सकता है. बाँझपन छोटी आंत में मौजूद बैक्टीरिया वनस्पति की मात्रा के कारण एक प्रमुख मुद्दा है. फसल निम्नलिखित पीबीएस / ए.ए. के साथ वॉशिंग बहुत महत्वपूर्ण है, और fecal बात या मलबे के कोई संकेत लुमेन से हटा दिया जाना चाहिए. बाँझपन हासिल किया गया है अगर यूवी बंध्याकरण निम्नलिखित इनक्यूबेटर में DMEM के साथ एक बाज़ ट्यूब में पाड़ के एक हिस्से को रखकर एक संकेत किया जाना चाहिए. स्थिति मेंबैक्टीरियल उपनिवेशवाद का, मीडिया उसका रंग पीला लाल से बदल के साथ पीएच बदल जाएगा. इस के साथ सौदा करने के लिए, आगे यूवी चक्र पीबीएस एंटीबायोटिक / कवकनाशी के एक उच्च एकाग्रता को रोकने के साथ धोने के साथ ही सलाह दी जाती है.
संवहनी और शिरापरक दोनों का उपयोग के साथ एक पाड़ पाने के संभावित संशोधन अवर रग Cava (IVC) और साथ ही SMA cannulate के लिए किया जाएगा. शिरापरक और नाड़ी पक्षों से Decellularization सभी तीन समाधान के लिए रहकर प्रयास किया जाना चाहिए. सतत decellularization दोनों पक्षों पर सकारात्मक दबाव होने से केशिकाओं फट सकता है.
इन वर्षों में इन विट्रो और इन विवो 6,9,12 में अलग सेल पाड़ संयोजन का उपयोग आंतों ते में प्रयास के एक नंबर दिया गया है. काम के बहुमत कोलेजन प्रकार मैं 6,7,13,22 के साथ लेपित ट्यूबलर nonwoven 95% पीजीए-5% PLGA scaffolds का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है. आंतों के साथ के बाद बोनेउपकला organoid इकाइयों (OUs) और चूहों की omentum में आरोपण की अवधि, वे तो tubularized किया जा सकता है पर बाहर और अंदर उपकला पर पेशी से अल्सर के रूप में. हालांकि, इन scaffolds के डिजाइन में porosity और सादगी ऐसी एक बायोरिएक्टर के रूप में इन विट्रो वातावरण में कृत्रिम आंत के बड़े टुकड़े की पीढ़ी के लिए अनुमति नहीं देता है. इसके अलावा अतिरिक्त प्राप्तकर्ता को जोड़ा जा सकता है कि एक जन्मजात संवहनी नेटवर्क की कमी के नैदानिक अनुवाद के लिए इस पाड़ के उपयोग की सीमा. पीजीए-PLGA scaffolds के साथ प्रयोगों के अलावा, अन्य समूहों आंत्र पथ की कठिनता को दोहराने नहीं है, जो दोनों के कोलेजन या बहन scaffolds, का इस्तेमाल किया है. एसआईएस विशेष रूप से आंतों ऊतक इंजीनियरिंग की ही पिछली प्रकाशित पद्धति है और यांत्रिक स्थिरता प्रदान करने और नेतृत्व, whilst सेल के विकास को बढ़ावा देने के decellularized scaffolds की क्षमता का प्रदर्शन, 150 से अधिक चिकित्सा सेटिंग में इस्तेमाल किया गया हैकोई immunogenic प्रतिक्रिया रही है. हालांकि, उचित मैक्रो और माइक्रो आर्किटेक्चर की कमी, पेट ते प्रयोजनों 9-11,23 के लिए 'अपने प्रयोग में खराब परिणाम के लिए प्रेरित किया.
हम वर्णन किया है decellularization पद्धति का लाभ आंतों स्टेम सेल आला द्वारा repopulation के लिए एक उपयुक्त वातावरण का प्रतिनिधित्व करते हैं कि इस तरह के luminal तहखाना-अंकुर वास्तुकला के रूप में सूक्ष्म विशेषताओं के संरक्षण में शामिल हैं. Macroscopic पहलू में, एक श्रेणीबद्ध संवहनी नेटवर्क की उपस्थिति ते आंत 21 के सभी परत के लिए पोषक तत्वों और ऑक्सीजन के प्रावधान की अनुमति, प्राप्तकर्ता को अनुलग्नक सक्षम हो जाएगा. क्या अधिक है, ऐसे कोलेजन, elastin और glyocosaminoglycans रूप ईसीएम घटकों के रखरखाव यांत्रिक विशेषताओं के लिए बल्कि सेलुलर प्रसार और भेदभाव का निर्देशन न केवल एक महत्वपूर्ण भूमिका है. सबसे महत्वपूर्ण बात, decellularization पद्धति की क्षमता बड़ी में बढ़ाया जा करने के लिएएक ही विशेषताओं को बनाए रखने whilst आर ऊतकों ते के नैदानिक अनुवाद के लिए एक महत्वपूर्ण विशेषता है.
एक संवहनी नेटवर्क के साथ एक प्राकृतिक आंतों मैट्रिक्स के विकास मेजबान से जोड़ा जा सकता है कि कृत्रिम आंत के बड़े भाग के निर्माण की अनुमति देता.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस प्रोटोकॉल के विकास के साथ उनकी मदद के लिए रिजनरेटिव मेडिसिन के जागो वन संस्थान धन्यवाद. हम ग्रेट Ormond स्ट्रीट अस्पताल दान से अनुदान द्वारा समर्थन स्वीकार करते हैं, फाउंडेशन Eugenio Litta (जिनेवा, स्विट्जरलैंड), चिकित्सा अनुसंधान परिषद, ब्रिटेन के लिए इंग्लैंड के सर्जन, स्पार्क्स बच्चों के मेडिकल चैरिटी, ब्रिटिश विदेश कार्यालय के रॉयल कॉलेज / अमरीका सेल सहयोग पुरस्कार और मित्तल रिसर्च फंड स्टेम. हम भी बाल स्वास्थ्य संस्थान में बाल चिकित्सा सर्जरी विभाग के लिए प्राप्त ऊतक इंजीनियरिंग प्रयोगशाला नवीनीकरण के अनुदान के लिए रॉयल सोसायटी / वोल्फसन फाउंडेशन को धन्यवाद देना चाहूंगा. पीडीसी और एसई ग्रेट Ormond स्ट्रीट अस्पताल बच्चों के दान के द्वारा समर्थित हैं.
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol solution, 70% in H20 | Sigma | 02877 | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma | 79382 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma | A5955 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | Oral and eye irritant; use protection |
| Sodium chloride | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 |
Riferimenti
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