「凍結割れ、「線虫C.の内部組織を露出させるための方法をタンパク質の局在化のための抗体に虫が 、実証されている。
C.を染色する抗体を用いた虫は 、比較的不透過性のキューティクルは、化学的または機械的な方法でバイパスする必要があります。 「凍結割れを「物理的に二つのスライド間の接着性の線虫を圧縮し、それらを凍結し、そして離れてスライドを引っ張ることにより線虫のクチクラをプルするために使用される一つの方法である。凍結割れは、化学処理をせずに、組織へのアクセスを獲得するための簡単かつ迅速な方法を提供し、様々な固定剤と共に使用することができる。しかしながら、標本の多くの損失をもたらし、必要な圧縮は、機械的にサンプルを歪める。実際には、良好な形態を有するサンプルの回収を最大化するために必要とされる。凍結割れは、特定の固定条件、サンプルの回収、または低非特異的染色のために最適ではなく、すべてのパラメータの一度にすることができます。非常に難しいの固定条件を必要とし、化学的にキューティクルを透過性にするために必要な化学処理を容認する抗体について、treatmen溶液中のインタクトな線虫のtが好ましい場合がある。抗体が必要な場合は軽量化の修正や最適な固定条件が不明である場合には、凍結割れが急速に抗体をアッセイすると、目的の抗原に特異的な細胞内および細胞内局在情報を得ることができる非常に便利な方法を提供します。
タンパク質の細胞と細胞内局在を決定するために、科学者たちは、伝統的には特定のタンパク質1を認識するように選択された抗体を有する組織のラベルが付いています。 Cなどのいくつかのモデル生物でのエレガンス 、抗体染色は、多くの場合、より迅速に結果が得られた分子遺伝学的技術、により置換されている。これらは、プロモーターと関心と緑色蛍光タンパク質の遺伝子のコード領域の間の遺伝子の融合からなる構築物で形質転換する生物を含む。しかし、分子技術は、真のプロモーターと高コピー数(C. elegansの通常の技術) の2,3での構築物の発現の変化を知ることで問題を含むアーティファクトの数、対象となります。したがって、抗体を用いた染色は、生体内でのタンパク質の機能を研究する多くの科学者のための目標である。
抗体を用いて組織を染色することは、困難な場合がありますので、tibodiesは、特定の立体構造1にそれらの抗原を認識することができる。例えば、抗体は、特定の方法で修正されただけの変性または完全な抗原を認識することができるし、 その場で抗原を認識しない場合があります。線虫における抗体染色の問題は、線虫のクチクラは、組織への抗体のアクセスをブロックし、比較的不透過性のバリアを形成するという事実によって悪化する。
Cの抗体染色のために使用される、いくつかの異なる方法があります。 (私たちの以前の研究4に概説されている) 虫 。無傷で染色する「ワームを、「法は凍結し、比較的硬い固定液(ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド)で解凍するために開発された、凍結融解サイクルは、固定液5の急速な浸透を可能にするためにキューティクルをクラックするのに役立ちます。固定後、キューティクルは、抗体の浸透を可能にするために透過処理した;方法は、薬剤、コラゲナーゼ、またはその両方を低減5-7で処理することを含んでいた。これらのTreatmentsは、形態を保ったが、多くの場合、抗体認識を減少または破壊された。代替方法は、抗体の浸透を可能にするために解剖8が含まれています。
「凍結割れを「抗体染色9月10日を可能にするために半無傷のワームの内部へのアクセスを得るための一つの方法です。コラゲナーゼおよび還元処置を避けながら、凍結割れが固定の様々な条件で行うことができる。線虫は、2接着剤スライドの間に配置された凍結した後、スライドを分離し、下部のスライド上の線虫のほとんどは、トップスライド上のキューティクルの多くを残している。下部スライドは固定剤に配置することができ、付着した線虫を有するスライド全体を、抗体染色手順を介して転送される。この方法は、2つの主要な困難を提示しません。まず、真剣にそれらを変形させることなく、線虫を分割するのに必要な圧力の正確な量を適用することは困難である。第二に、ワームの多くはSではないでしょういずれかのスライドにチェックを入れて、固定液やリンスに失われます。しかし、適切なスライドと実践では、この方法は急速に固定剤および抗体は、多種多様で使用することができる合理的な形態を有する線虫を生じる。
この方法は、実験の目的に応じてわずかに変化させることができる。単一線虫の染色( 例えば 、単一の形質転換体は、抗体染色を変化させたか否かを決定するために)所望される場合、最大の密着性と摺動する(しかし、より高いバックグラウンド染色)は、(下記参照)、このような余分なポリリジンを有する実験室で調製されたスライドを使用することができる。線虫がこれら注視後にポリリジンにもっと悪い付着するので、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド固定のため、高い密着性スライド(実験室用意ポリリジンスライド)が、使用されるべきである。野生型線虫は、メタノールおよび/またはアセトンで固定されている場合は、下側の接着性と摺動し、低いバックグラウンド染色を用いるべきである(市販またはlaboratoryに準備スライド)。抗体および固定剤の種々の研究室で使用されている場合、必要になるまで、スライドの選択は、前もって調製し、保存することができる。
線虫の組織へのアクセスが獲得された後、抗体染色手順は、(より長いインキュベーション組織の特性よりもむしろ細胞1,11で)標準的な方法に従う。
凍結割れプロトコルは、Cの抗体染色のためのいくつかの方法の一つである虫。これは、ワームを染色するための比較的簡単な方法を提供していますが、最適な結果を得るための具体的な試薬と実践を必要としません。 ( 図1に概要)の重要なステップは、1)ステップ1と線虫の2)マニュアルの圧縮(ステップ2および3を参照のこと)迅速な固定をする(ステップ3)?…
The authors have nothing to disclose.
資金は、NSF CCLI番号0633618とオハイオ大学によって提供されました。いくつかの株は、線虫の遺伝学センターから提供された。大学院生Reetobrata Basuさんは、ビデオに表示されます。
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
poly-L-lysine slide (ESCO brand) | Fisher | 12-545-78 | Sigma brand slides also suitable |
poly-L-lysine hydrobromide | Sigma | P1524 | IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical |
single frosted edge slides | Fisher | 48312-002 | Other brands are suitable |
sodium azide | Sigma | S2002-25G | TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution |
coplin staining jar | VWR | 47751-792 | Other brands are suitable |
5-slide mailer | Electron Microscopy Science | 71549-01 | One of many different brands of small slide holder, suitable for staining |
Paraformaldehyde | VWR | MK262159 | IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water. |
Glutaraldehyde solution, 25% in water | Sigma | G 5882 | IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water. |
Triton X-100 | VWR | EM-9410 | Other brands are suitable |
Bovine Serum Albumin | Fisher | ICN820451 | Other brands are suitable |
Donkey Serum, lyophilized | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | Other brands are suitable |
Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling | Jackson Immunoresearch | 715-165-150 | This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody). |
n-propyl gallate | Fisher | ICN10274750 | Other brands are suitable |
DAPI, 4′,6′-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | D 9542 | TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure |
Whatman #1 15 cm diameter filters | Fisher | 09805G | |
Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm | VWR | 48393-252 | #1 1/2 thickness is optically best |
Microscope slide folder | VWR | 48429-092 | Other brands are suitable |