Summary
我々は、市販のマイクロウェルプレートを使用して、均一なサイズや組成制御の腫瘍スフェロイドの大量（数十万、何千）の生成のためのプロトコルを紹介する。
Abstract
腫瘍スフェロイドは、ますます三次元での腫瘍細胞の挙動のための重要なin vitroモデルとして認識されている。より生理学的に関連する従来の粘着性シートの文化よりも、彼らはより正確に、実際の腫瘍に存在する複雑性との相互作用を再現。より良好な腫瘍生物学、または新規の治療薬の有効性を評価するために、このモデルを利用するためには、制御された様式で、かなりの数で、再現性スフェロイドを生成できることが必要である。
AggreWellシステムは、単一細胞の懸濁液を遠心分離し、その中にピラミッド状のマイクロウェルの高密度アレイからなる。細胞の数は、各マイクロウェルの底部でクラスタリングし、関与する異なる細胞型の数との比は、実験者によって導入された懸濁液の特性にのみ依存する。従って、我々は任意のサイズであり、組成物の腫瘍スフェロイドを生成することができる基盤となるプラットフォーム技術を修正する必要が出。順番に培養表面面積1平方センチメートルあたりマイクロウェルの数百人は、非常に高い生産レベルは簡単、非労務集約型のプロセスを介して達成することができることを確認してください。そこで我々は、このプロトコルが腫瘍スフェロイド分野の研究者に広く有用であることを期待しています。
Introduction
腫瘍細胞は、それらを培養プラスチック上よりも、3次元培養では異なる動作をし、より生理的に関連するシステム1に移行する際、従来の組織培養プラットフォーム上で同定された治療薬は有効性を失う可能性があることことを示す証拠が増え体がある。これは、両方の基礎となる生物学への洞察を得るために、これらの条件下で、癌細胞の挙動を研究するために、また、診療所にスクリーニング施設から新たな治療薬の移行の成功率を高めることが望ましい。長い歴史を持つ一つの有用なモデル系は、腫瘍スフェロイド1,2として知られている癌細胞の三次元クラスターを使用する。理想的には、スフェロイドを形成するための技術は、大きさおよび組成、実験者によって制御され、均一なスフェロイドの大量生産を可能にするであろう。ハンギングドロップやウェルプレートに接近しながら、3,4は、これらの再のいくつかを満たすことができますquirements、スループットは一般に限られており、スフェロイドの多数の発生は労働集約的なタスクとなる。
我々は最近、再生医療分野5で同様の課題を解決するためのシステムを開発した。 （ 図1参照） を密に充填されたミクロンスケールの一連のウェル内に強制凝集を用い、このアプローチは、複数の細胞型6との混合物、ならびに種々の生体材料7の組み込みを含む細胞の任意の数から、スフェロイドの生成を可能にする。数千またはそれ以上の数百数千- -スフェロイドを大量に形成され、それらが少なくとも一つの8〜2（未発表の観察）週間、培地交換で形成されたマイクロウェルに直ちに抽出又は維持することができる。したがって、このシステムはEFFEの評価のための均一な多数の、再現性の腫瘍スフェロイドの生成に適しています小説抗腫瘍剤や基本的な生物学的調査のctiveness。
Protocol
注：マイクロウェルプレートは、所望の結果に応じて、様々なフォーマットで提供されています。仕様および各フォーマットで使用されるべきであるセルの最小数と最大数のおおよその指針を表1に示す。小さいマイクロウェルは、鋭いポイントにテーパ、そしてスフェロイド間の変動は小さいサイズでより顕著になるが、このように全く下限サイズ制限は、ありません。わずか20個の細胞それぞれの平均からスフェロイドのルーチン生産は8簡単です。より大きなマイクロサイズが完全に先細りしていない、したがって、各マイクロウェル内の複数の小さな球状体を生じ得る少数の細胞からスフェロイドを形成しようとします。 AggreWell 400Exプレートを使用する際に、表面特性のわずかな違いのために、界面活性剤溶液（ステップ1.2）で準備はオプションではありません。
このプロトコルは、AggreWell 400プレートを使用することに基づいている - 他のフォーマットの短所のためULT 表1。各ウェルにロードされる細胞の数は、各スフェロイドのためにクラスタ化されるべき細胞の数で含有するマイクロウェルの数を掛けることによって決定される。例えば、個々に1000個の細胞からのスフェロイドを生成するために、各ウェル（1200スフェロイド回1,000細胞ごと=）1.2×10 6個の細胞をロードする必要があります。細胞密度は、細胞が0.4ミリリットルの容量でロードされることを考えると計算されなければならない。だから、1000個の細胞それぞれから形成されたスフェロイドの例については、0.4ミリリットル中に1.2×10 6個の細胞、1mlあたり3×10 6細胞の密度に変換されます。
1。セルを受信するための準備マイクロウェル
- マイクロウェルプレートは、提供されるように無菌であり、唯一のそのような層流バイオセーフティキャビネットなどの無菌環境でのパッケージから削除する必要があります。無菌性は、プロトコル全体で維持されるべきである。無菌性が損なわれるべきで、ウェルを用いて水中の70％エタノールを用いて再滅菌されているオプションの手順を実行します。
- 各未使用のウェルに70％エタノールの0.5ミリリットルを追加します。これは、一方の側に液体を加え、それが表面に広がるさせることなく、表面上に垂直にドロップすることによって低減することができるが、いくつかのマイクロウェルは、捕捉気泡う。蓋を交換してください。
- エタノール蒸気を迅速に気泡を透過べきであるが、多数が存在する場合、それはそれらを除去することが望ましい場合がある。 2000 X gで2分間遠心。それは、ロータがこの速度で適切なバランスを確保することが重要であることに注意してください。
- 低倍率の倒立顕微鏡を使用して、ベリファイ気泡がマイクロウェルから除去されている。
- 室温での蓋の上で5分間インキュベートする。
- 吸引エタノール。プレートは、今すぐに使用できる無菌水又はPBSで洗浄し、又は保存のために空気乾燥させることができる。
- 細胞がマイクロウェル表面と相互作用しないことを確実にするためには、界面活性剤を用いて調製することができる。一般に、ある最初にこの手順を実行し、その後、界面活性剤でコーティングされたマイクロウェルとし、せずに生成されたスフェロイドを比較することをお勧め。
- 各ウェルにリンス溶液0.5mlを加える。これは、一方の側に液体を加え、それが表面に広がるさせることなく、表面上に垂直にドロップすることによって低減することができるが、いくつかのマイクロウェルは、捕捉気泡う。蓋を交換してください。
- 気泡を除去するために2000×gで2分間遠心分離する。それは、ロータがこの速度で適切なバランスを確保することが重要であることに注意してください。
- 低倍率の倒立顕微鏡を使用して、ベリファイ気泡がマイクロウェルから除去されている。
- 室温での蓋の上に、少なくとも30分間インキュベートするか、4℃で一晩適切に乾燥を防ぐために密封された場合に必要になるまで、プレートを、ウェル中の界面活性剤溶液で4℃で保存してもよい。
- 使用直前に無菌水またはPBSでプレートを洗浄してください。プレートを許可しないコーティング後に乾燥させる。
2。細胞を調製
NOTE：細胞調製の詳細は検討されて特定の細胞型にいくらか変化するであろう。しかし、我々は、ここで説明ライン、ならびにヒトおよびマウス胚性幹細胞（ESC）、ヒト人工多能性幹細胞（IPSC）、線維芽細胞、推定上の原始内胚葉を含む細胞の広い範囲のに有効であることが、これらの状態を観察しているおよび間質細胞。他のグループは、間葉系幹細胞から軟骨9、多能性幹細胞10からの神経前駆体の標準化された生成を含む幅広い用途に成功し、このシステムを採用して、毒性学的には肝細胞11とサンショウウオ12における脊髄再生の評価に分析しています。 HT29細胞を操作するための特定のプロトコルはここに示されています。
- 中で培養、HT29細胞のT75フラスコで始まる+ 10％FBS
- 吸引成長フラスコから培地およびトリプシンの3ミリリットルを追加します。
- 37℃で5分間、細胞をインキュベート
- 増殖培地3mlを添加することによってトリプシン消化を停止する。細胞計数のためにアリコートを取り、15ミリリットルの遠心管に残りを移す。
- 200×gで5分間遠心分離します。
- 遠心分離の進行中に、細胞を数える。
- 吸引トリプシン/培地混合し、上記のように計算量が必要な細胞密度で決まる、新鮮な増殖培地と交換してください。
- （オプション）任意の塊を除去するために、ストレーナーを通して細胞懸濁液を渡します。注：細胞採取条件がラインの間に変動します。 例えば、目的の細胞を継代するための解離プロトコルが利用可能である場合、それは出発点として使用されるべきである。感受性細胞株は、トリプシンの使用では、過剰な細胞死をもたらし得る。これらのケースでは、我々は代替dissociatiとしてのTrypLEを用いて良好な結果を観察している試薬8に。細胞は、解離中に塊状になり、生存能力を失った場合、酵素溶液にDNA分解酵素を添加すると、これを解決することがあります。解離時間を短縮し、細胞塊を分割するチュレーションのステップを採用することも実行可能性を高めることができます。
3。回転楕円体の形成
NOTE：スフェロイドは、媒体の様々な製剤で生成することができる、しかし、初期の試験は、細胞が培地組成を変化させるの結果から、3次元培養系への移行の結果を区別するために、培養した培地を用いて行うべきである。
- 各ウェルに増殖培地の0.4ミリリットルを追加します。
- 気泡を除去するために2000×gで2分間遠心分離する。それは、ロータが遠心分離前、この速度で適切なバランスを確保することが重要であることに注意してください。
- 低倍率の倒立顕微鏡を使用して、ベリファイ気泡がマイクロウェルから除去されている。
- 0.4ミリリットルを追加（上記で計算）に必要な密度で細胞懸濁液。静かにマイクロウェルに気泡を導入することなく、上下にピペッティングにより混和する。これは、細胞が均一に一貫性スフェロイドを得るためには、ウェル全体に分散されることを保証することが重要である。
- 200×gで5分間遠心分離します。プレートは遠心分離中に自己のレベルをしない場合、対流はマイクロウェル全体の細胞の不均一な分布でその結果を生じることがある。重量がプレートキャリヤーの両側に均等に分配されるそのため、プレートは、ならびに他のプレートに対して内部的にバランスされるべきである。
注：不均一な細胞分布の証拠が見られた場合、それはプレートキャリア上のピボットポイントに潤滑少量を適用する必要があるかもしれない - 手順については、遠心分離機のメーカーに相談してください。
NOTE：細胞がマイクロウェル内に遠心分離されると、それらは合理的に抵抗であるプレートのマイナー動きから洗い流すに重要。培地スロッシングになり、急激な動きは避けなければならないが、遠心分離器から顕微鏡やインキュベーターにプレートの移動は、有意な細胞の変位を引き起こすべきではありません。
- 倒立顕微鏡を用いて、細胞がマイクロウェル内でクラスタ化され、それらが均等に十分に分散されていることをしていることを確認してください。
- 37℃で一晩インキュベートする。
- 倒立顕微鏡を用いて、スフェロイド形成過程を観察する。いくつかの細胞株は、他の人が時間がかかることがあり、24時間以内にコンパクトなスフェロイドを形成することになる。 HT29細胞中で凝集するクラスタからの進行は、 図2に示されている。
- マイクロウェルからスフェロイドを回収し、静かにピペットでそれらを噴射することにより浮遊培養に移す。あるいは、培地交換8にその場でスフェロイドを維持する-継続時間は、それらの初期サイズおよび増殖速度に依存し、そのデフ彼らが形成されたマイクロウェルを脱却するまでの時間をINE。
- パスツールピペットを用いてウェルの縁でスフェロイド、吸引媒体を失うことなく、メディアを交換してください。ゆっくりとそれはメニスカスから液体を引き出す始めるまでダウンして先端を持って、そしてそれが低下すると、メニスカスを下に従ってください。その後、同じ場所ではよく壁に新鮮な培地を追加します。いくつかのスフェロイドはメディアが常に吸引し、同じ位置に置き換えられている場合は、この数は十分に大きな数字と比較して小さいままになる、失われる可能性があります。
Representative Results
解剖学的起源の異なる複数の腫瘍株由来のスフェロイドは、容易に生成され、懸濁培養中に抽出することができる。 図3は、各条件下で高度に均一な球状体集団と、この方法によって得る一貫したサイズ制御を示す図である。 LNCaP前立腺癌細胞が不規則な境界を少なくコヒーレントスフェロイドを生じたながら、行動の明確なライン間の違いは（可能な理由のための議論を参照して、HT29結腸癌細胞及びTE6食道癌細胞が急激に定義された境界を持つ高密度に充填されたスフェロイドを形成しても表示されます）。特に大きなサイズでのLNCaP凝集体は、目に見えての四角錐形状を維持するのに対し、より一貫性の凝集体が強い内力も、でもまだ彼らが形成されたマイクロウェル中ながら、より対称的な形への崩壊をもたらしたマイクロウェル。入力セル番号と物理の関係結果として回転楕円体のiCalの大きさは、変数の数に依存します。細胞当たりの体積および使用する細胞の数の積に基づいて理論的な体積は、順番に起因して単一細胞懸濁液段階における細胞の損失、ならびに過度に小さな凝集による損失を含むことができる細胞損失、減少させることができる不十分な隣人の数、およびコアの制限と壊死を輸送することにより、過大な集合体から。大きさはまた、凝集プロセス中に発生し得る任意の増殖によって影響される。これらのパラメータは細胞株由来の細胞株に変化するように、特定の物理的寸法のスフェロイドが望まれる場合に導入するための細胞の正確な数は、実験的に決定されなければならない。第一近似として、スフェロイドの直径が組み込まれた細胞の数の立方根とともに増加することが予想される-細胞の数、例えば 8倍の増加は、スフェロイドの直径の倍増をもたらすはずである。
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図1。回転楕円体の生産の概略。マイクロシステムは、細胞を遠心分離することができるに密集し四角錐状のマイクロウェル（400μMサイズの1cm 2あたり625）の配列で構成されます。細胞は、傾斜側壁によって一緒にされる、得られたスフェロイドの大きさは、用いられる細胞懸濁液の濃度を変えることによって制御される。
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図2。スフェロイドにクラスタ化されたセルの集合体を図スフェロイドは700 HT29細胞各々から形成された。直ちに遠心分離（A）の後、細胞を緩く各マイクロウェルの底部にクラスタ化される。クラスタが均一にこの場合は、右下の方にオフセットされていることに注意してください。これにより、クラスタのサイズは、アレイ全体で一貫性を維持提供良い。重要なクラスタサイズの違いは、他に、アレイの一方の側から見ている場合は、ステップ3.5で注意を参照してください。 24時間（B）のインキュベーションの後、細胞間の接着力は、次に（C）で抽出され得る、クラスターは、コヒーレントスフェロイドを形成するために凝集して生じている。
| マイクロウェルフォーマット | |||
| AggreWell 400 | AggreWell 40EX | AggreWell 800 | |
| マイクロウェルの幅（al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">µm ) | 400 | 400 | 800 |
| 1cm 2当たりのマイクロウェル | 625 | 625 | 156.25 |
| ウェルあたりマイクロウェル | 1200 | 4700 | 300 |
| マイクロウェルあたりの最小のセル* | N / A | N / A | 2000 |
| マイクロウェル当たりの最大細胞* | 2000 | 2000 | 万 |
| ウェル当たり最小のセル* | N / A | N / A | 6×10 5 |
| ウェル当たりの最大細胞* | 2.4×10 6 | 9.4×10 6 | 3×10 6 |
| 1.1.1 - 70％エタノールの体積（ml） | 0.5 | 2.0 | 0。5 |
| 1.2.1 - リンス液の容量（ml） | 0.5 | 2.0 | 0.5 |
| 3.2 - 中プリロード·容量（ml） | 0.4 | 1.6 | 0.4 |
| 3.5 - セル負荷の容量（ml） | 0.4 | 1.6 | 0.4 |
| *マイクロウェルあたりの細胞の数は、この値は、使用される特定の細胞の大きさに応じて変化する近似値としてのみであり、経験的に決定されるべきである | |||
表1。オプションやプロトコルの変更をAggreWell。
Discussion
我々は、均一な球状体の多数の異なるソースからの複数の細胞株から生成することができる、それによってシステムを構築しています。我々は、これらの条件下で、スフェロイドを形成しない接着細胞株に遭遇していない。我々は以前しかし、今日まで、この問題は腫瘍系で生じていない、アノイキス5,8を起こしやすい集団における細胞の損失を観察した。システムは、24ウェルおよび6ウェルフォーマットのほか、現在開発中の5万マイクロウェルそれぞれを含むプロトタイプのバイオリアクターにおけるマイクロウェル全体で一貫性のある動作で、表面積が任意に拡張可能である。
非対称性が懸念される回転楕円べき、ステップ4.8でのインキュベーション時間は二、三日に増加させることができる。スフェロイドはまた、しかしながら、この場合には注意が互いのWiに接する球状体として、十分に低い培養密度を維持するために注意しなければならない、対称性を増加させるためにマイクロウェルからの抽出後の期間インキュベートすることができる多くの場合、より大きな構造へと融合しちゃう。このような理由から、我々は以前に凝集体が主な制限は、回転楕円体の大きさで、形成されたされたマイクロウェル内の文化を維持している。これは、次に、増殖速度と初期サイズ8の両方の関数であり、マイクロウェルプレート内で培養拡張が計画されている場合、これは、事前に考慮すべきである。異常増殖を防止するためのオプションが、それが発生した場合には、より小さなスフェロイドで始まる、またはAggreWell 800プレートの大きなマイクロウェルを使用することのいずれかを含む。
スフェロイドが経時的コヒーレンスが増加するのに失敗した場合、ある潜在的原因は、細胞死であってもよい。特に高度代謝活性のある細胞の大きな集合体で、酸素や必須栄養素の代引き物質移動の制限は壊死性コア2になることができます-このように非粘着性の球状体は、単純に、過剰な細胞死の結果であり得る。別の方法として、機械的なcohe測定スフェロイドのシオンは、所与の細胞株13の転移能との関係で、細胞間の結合力を評価するために使用されてきた。これは、おそらく、そのような面積比に丸みと境界として形態学的パラメータを用いて、回転楕円体の形状および転移能との関係を調べることは興味深いであろう。
スフェロイドの機械的および形態的特性を調査することに加えて、マイクロウェルシステム内のアセンブリは、複数の細胞型および/ または生体材料6,7の組み合わせからなる混合組成物のスフェロイドの大規模生産を可能にする。他の細胞型を有する腫瘍細胞の相互作用は、従って、それは、例えば、線維芽細胞および内皮細胞と組み合わせた腫瘍細胞からスフェロイドを生成するために重要であり得る、より密接にインビボ 14 の腫瘍の挙動をモデル化するために重要である。種々の生体材料の微粒子もまた組み込まれてもよく、SPHに影響を与えることができる直接細胞7,15との相互作用を介して、また回転楕円体16の内部への増殖因子およびサイトカインの放出制御のための貯水池として両方eroid性質。
無菌性についての懸念がある場合は前の実験の一部としてインキュベーター中でいくつかの時間を費やしていることができるいくつかのウェルは、以前に使用されてきたマイクロウェルプレートを用いて作業する場合、例えば、ウェルを70％エタノールで再滅菌することができる水中で。
スフェロイドが形成されると、それらはまた、細胞ストレーナーの上に懸濁液を通過させることによって、取り込まれなかった残余の細胞から分離することができる。スフェロイドが保持される一方、個々の細胞は、通過する。スフェロイド培養の過程で潜在的に転移細胞を流している疑いがある場合は、この手順を複数回実行することが望ましいかもしれない - 最初に取り込まれていない細胞を除去し、続いてpurifieを単離するスフェロイドではオフに与えられた細胞のD集団。
Disclosures
博士Ungrinは発明者としてAggreWell技術の経済的利害関係を持っています。
Acknowledgments
この作品は、博士Ungrinに新しい調査官スタートアップ助成金の下で、カルガリー大学によって資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AggreWell 400 plate | StemCell Technologies Inc. | 27845/27945 | |
| Rinsing Solution | StemCell Technologies Inc. | 07010 | |
| Cell strainer (37 µm) | StemCell Technologies Inc. | 27215 | |
| PBS | VWR / LONZA | CA12001-676 | |
| Trypsin-Versene (EDTA) | VWR / LONZA | CA12001-660 | |
| DMEM | VWR / LONZA | CA12002-212 | |
| FBS | VWR / LONZA | CA-95042-112 | |
| TrypLE | Invitrogen / Life Technologies | 12605010 | |
| Inverted microscope | VWR / Motic | CA19000-610 | |
| Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates | VWR / Beckman | CABKA99465, CABK369704, CABK392806 | |
| Laminar flow biosafety cabinet | ESBE / Baker | BKR-SG603AHEUVSP |
References
- Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Sherar, M. D., Noss, M. B., Foster, F. S. Ultrasound backscatter microscopy images the internal structure of living tumour spheroids. Nature. 330 (6147), 493-495 (1987).
- Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J. Vis. Exp. (51), 2720 (2011).
- Naber, H. P. H., Wiercinska, E., Ten Dijke, P., Van Laar, T. Spheroid Assay to Measure TGF-β-induced Invasion. J. Vis. Exp. (57), e3337 (2011).
- Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Reproducible Zandstra, P. W. ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).
- Bauwens, C. L., Song, H., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Engineering. Part A. 17 (15-16), 1901-1909 (2011).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., Ungrin, M. D., Zandstra, P. W., McDevitt, T. C. Incorporation of biomaterials in multicellular aggregates modulates pluripotent stem cell differentiation. Biomaterials. 32 (1), 48-56 (2011).
- Ungrin, M. D., Clarke, G., et al. Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics. Biotechnology and Bioengineering. 109 (4), 853-866 (2012).
- Markway, B. D., Tan, G. K., Brooke, G., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J., Doran, M. R. Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures. Cell Transplantation. 19 (1), 29-42 (2010).
- Kozhich, O., Hamilton, R., Mallon, B. Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reviews and Reports. , 1-6 (2012).
- Fey, S. J., Wrzesinski, K. Determination of Drug Toxicity Using 3D Spheroids Constructed from an Immortal Human Hepatocyte Cell Line. Toxicological Sciences. , (2012).
- Mchedlishvili, L., Mazurov, V., et al. Reconstitution of the central and peripheral nervous system during salamander tail regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).
- Butler, C. M., Foty, R. A. Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry. J. Vis. Exp. (50), e2739 (2011).
- Xu, K., Buchsbaum, R. J. Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture. J. Vis. Exp. (62), e3760 (2012).
- Baraniak, P. R., Cooke, M. T., Saeed, R., Kinney, M. A., Fridley, K. M., McDevitt, T. C. Stiffening of human mesenchymal stem cell spheroid microenvironments induced by incorporation of gelatin microparticles. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 11, 63-71 (2012).
- Purpura, K. A., Bratt-Leal, A. M., Hammersmith, K. A., McDevitt, T. C., Zandstra, P. W. Systematic engineering of 3D pluripotent stem cell niches to guide blood development. Biomaterials. , (2012).
