מציאה גן בקנה מידה גדולה ב<em> ג elegans</em> שימוש בספריות האכלת dsRNA ליצור פנוטיפים הפסד של הפונקציה חזקות
Summary
בעוד dsRNA ההאכלה בג elegans הוא כלי רב עוצמה כדי להעריך את תפקוד גן, פרוטוקולים הנוכחיים למסכי האכלה בקנה מידה גדולה יביאו ליעילות מציאה משתנה. אנו מתארים פרוטוקול משופר לביצוע מסכי האכלת RNAi בקנה מידה גדולה, כי תוצאות במציאה יעילה ולשעתקו מאוד של ביטוי גנים.
Abstract
התערבות RNA על ידי האכלת חיידקי תולעים להביע dsRNAs כבר כלי שימושי כדי להעריך את תפקוד גן בג elegans. בעוד אסטרטגיה זו עובדת היטב כאשר מספר קטן של גנים ממוקדים למציאה, מסכי האכלה בקנה מידה גדולה מראים את יעילות מציאה משתנה, אשר מגבילה את השירות שלהם. יש לנו דקונסטרוקציה פרוטוקולי מציאה RNAi שפורסמו בעבר ונמצאו כי המקור העיקרי למציאה מופחתת ניתן לייחס לאובדן של פלסמידים dsRNA-קידוד מהחיידקים האכילו את בעלי החיים. בהתבסס על תצפיות אלה, פיתחנו פרוטוקול האכלת dsRNA שמקטין באופן משמעותי או מבטל הפסד פלסמיד כדי להשיג מציאה תפוקה יעילה, גבוהה. אנו מראים כי פרוטוקול זה יהיה לייצר דפיקה חזקה, לשחזור למטה של ג elegans גנים בסוגי רקמות רבים, כוללים תאי עצב, וייאפשרו מציאה יעילה במסכים בקנה מידה גדולים. פרוטוקול זה משתמש האכלת dsRNA זמינה מסחריספרייה ומתארת את כל צורך לשכפל את הספרייה ולבצע מסכי dsRNA הצעדים. הפרוטוקול אינו מחייב שימוש בכל ציוד מתוחכם, ולכן יכול להתבצע על ידי כל ג elegans מעבדה.
Introduction
מבחינה היסטורית, מסכי גנטיים בג elegans בוצעו על ידי טיפול בבעלי חיים עם mutagen כימי כגון methanesulfonate אתיל ליצור מוטציות אקראיות בתוך ה-DNA. צאצאים או grandprogeny של בעלי החיים mutagenized אז בודדו תערוכה שפנוטיפ חריג רצוי. המוטציה אחראית לגרימת פנוטיפ מכן זוהתה באמצעות תהליך מיפוי עתיר עבודה או על ידי רצף הגנום כולו של התולעת שעברה מוטציה. ישנם יתרונות רבים לביצוע מסכי mutagenesis הכימי כגון הם יוצרים נגעים קבועים בתוך הגנום התולעת שיכולה לגרום לשני פנוטיפים לזכות-of-פונקציה ואובדן של פונקציה, אבל תהליך המיפוי הוא איטי ויקר.
התערבות פעמיים תקוע RNA (dsRNAi) מספקת אמצעים חלופיים כדי לזהות גני המעורבים בתהליכים ביולוגיים חשובים. בשיטה זו, dsRNA רצף הקידוד של גני אנדוגניים התאמה מוחדר לתולעת.DsRNA מעובד in vivo כדי ליצור RNAs (21-22 נוקלאוטיד) הקטן שישמש כמדריכים כדי למצוא להיקשר mRNAs אנדוגני ההתאמה, מיקוד אותם להשמדת 1. הליך זה הוא מהיר יחסית, אבל בגלל dsRNA מטרות mRNA ולא ה-DNA, רק פנוטיפים ירידה של הפונקציה הם נצפו באמצעות גישה זו.
מבוא של dsRNAs לבעלי חיים יכול להיות מושגת על ידי הזרקה ישירה של dsRNA 2, על ידי שריה בחי dsRNA 3, או על ידי האכלת בעלי חיים חיידקים שמבטאים 4 dsRNA. כל אחת משיטות אספקה אלה גורם לתופעות מציאה מערכתיות כמו רוב התאים של החיה להביע SID-1, ערוץ הטרנסממברני מסוגל לייבא dsRNA 5. שימש במקור כגישת גנטיקה הפוכה למציאת הביטוי של גנים בודדים אחד בכל פעם, את הפיתוח של שתי ספריות האכלה עכשיו מאפשר מסכי גנטיים בקנה מידה גדולה. DsRNA הספריות, הזמינות מסחרי מכילות baהשיבוטים cterial המייצגים אף אחד 55% או 87% מכל ג elegans גנים 6, 7.
למרבה הצער, מסכי האכלת dsRNAi בקנה מידה גדולה לעתים לגרום יעילות מציאה משתנה 8-10. בעוד שהרמה המוחלטת של מציאה ידי RNAi אינה נמדדת בקלות, ביעילות מציאה מופחתת נצפתה במסכים בקנה מידה גדולים חייבת להיגרם על ידי mRNAs גן ספציפי שיורית שלברוח השפלה ידי RNAi. זה, בתורו, יכול להיות תוצאה ישירה של אובדן פלסמיד dsRNA מחיידקים נמאס לבעלי חיים במסכים אלה. תמיכה ברעיון הזה, חיות מאכילה את התערובות של חיידקים, בהם רק 50% מהחיידקים להביע dsRNAs נגד גן ממוקד, להראות מצטמצם באופן דרמטי (אם יש) השפעות מציאה כאשר לעומת השליטה האכיל חיות 11. של מציאה גן במידה הופכת לדאגה קריטית בעת ביצוע מסכי dsRNAi כמו רוב הגנים בג elegans הוא haplosufficient וכך ביטוי גנים חייב להיות מופחת על ידי t 50% לפחותo לגרום לאובדן של פונקצית פנוטיפים 12.
יש לנו בשימוש בפרוטוקולי האכלה שפורסם בעבר לבצע מסכי בקנה מידה גדולה ומצאנו את אותו אפקט מציאה משתנה שדווח על ידי אחרים 8-10. בחיפוש אחר סיבות אפשריות, מצאנו כי כמעט 60% מהחיידקים האכילו את חיות במסך איבדו את הפלסמיד dsRNA. פיתחנו פרוטוקול כפילויות והקרנת ספרייה שמפחית באופן משמעותי או מבטל הפסד פלסמיד ומאוד משפר את יעילות מציאה. פרוטוקול זה מתאים לביצוע מסכי בקנה מידה גדולים בג elegans ויכול לשמש מסך אחד משתי ספריות dsRNA הזמינות המסחרית. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מוצאים כי למעשה 100% מהחיידקים נמאס לבעלי חיים במסך לשמר את פלסמיד dsRNA הקידוד ולגרום לנשירה חזקה וpenetrant מאוד של פנוטיפים פונקציה בכל הרקמות שנבדקו.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש לנו תיארתי פרוטוקול שמשתמש בספריית האכלת dsRNA זמינה מסחרי כדי לבצע מסכי בקנה מידה גדולה בג elegans. אנו מספקים את כל ההוראות כדי לשכפל את הספרייה ולהשתמש בו ביעילות. אנו מראים כי גישה זו היא מסוגלת לזהות גני המעורבים בתהליכים ביולוגיים שונים ברקמות שונות של בעלי ה?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מן המכונים הלאומיים לבריאות MH097163. כמה זנים סופקו על ידי CGC, אשר ממומן על ידי משרד NIH של תוכניות תשתיות מחקר (P40-OD010440).
Materials
| Reagent/Material | |||
| 96-well Falcon flat bottom plate | Fisher Scientific | 353072 | sterile |
| adhesive foil | USA Scientific | 2923-0100 | |
| Nunc omniplate | Fisher Scientific | 267060 | |
| 2.0 ml deep 96-well polypropylene Masterblock | USA Scientific | 5678-0285 | autoclavable |
| Lids for deep well plates | USA Scientific | 5665-6101 | |
| 50 ml combitips | USA Scientific | 4796-5000 | individually wrapped |
| Reservoir | USA Scientific | 2977-8500 | autoclavable |
| 12-well plates | USA Scientific | CC7682-7512 | individually wrapped |
| dsRNA feeding library | OpenBiosystems | RCE1181 | store -80 °C |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Tetracycline | Fisher Scientific | BP912-100 | |
| Carbenicillin | allow 2-4 weeks for delivery www.biochemicaldirect.com | ||
| Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A | Affymetrix | 10906 | for worm plates |
| Equipment | |||
| Brayer roller | USA Scientific | 9127-2940 | |
| Boekel 96-pin replicator | Fisher Scientific | 05-450-9 | autoclavable |
| microshaker | Thomas Scientific | 1231A93 | 3 mm orbit |
| 12 channel multichannel pipet (0.5-10 μl) | USA Scientific | 7112-0510 | |
| 12 channel multichannel pipet (30-300 μl) | USA Scientific | 7112-3300 | |
| Repeater Plus manual pipettor | USA Scientific | 4026-0201 |
Riferimenti
- Mello, C. C., Conte, D. Revealing the world of RNA interference. Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282 (5388), 430-431 (1998).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Jose, A. M., Smith, J. J., Hunter, C. P. Export of RNA silencing from C. elegans tissues does not require the RNA channel SID-1. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2283-2288 (2009).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
- Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).
- Simmer, F., et al. Genome-wide RNAi of C. elegans using the hypersensitive rrf-3 strain reveals novel gene functions. PLoS Biol. 1, 77-84 (2003).
- Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat. Genet. 33 (1), 40-48 (2003).
- Sieburth, D., et al. Systematic analysis of genes required for synapse structure and function. Nature. 436 (7050), 510-517 (2005).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), (2001).
- Hodgkin, J. Karyotype, ploidy, and gene dosage. WormBook. , 1-9 (2005).
- Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).
- Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436 (7050), 593-597 (2005).
- Lackner, M. R., Nurrish, S. J., Kaplan, J. M. Facilitation of synaptic transmission by EGL-30 Gqalpha and EGL-8 PLCbeta: DAG binding to UNC-13 is required to stimulate acetylcholine release. Neuron. 24 (2), 335-346 (1999).
- Bastiani, C. A., Gharib, S., Simon, M. I., Sternberg, P. W. Caenorhabditis elegans Galphaq regulates egg-laying behavior via a PLCbeta-independent and serotonin-dependent signaling pathway and likely functions both in the nervous system and in muscle. Genetica. 165 (4), 1805-1822 (2003).
- Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. J. Neurosci. 21 (6), 2001-2014 (2001).
- Terami, H., et al. Genomic organization, expression, and analysis of the troponin C gene pat-10 of Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 146 (1), 193-202 (1999).
- Novelli, J., Page, A. P., Hodgkin, J. The C terminus of collagen SQT-3 has complex and essential functions in nematode collagen assembly. Genetica. 172 (4), 2253-2267 (2006).
- Brundage, L., et al. Mutations in a C. elegans Gqalpha gene disrupt movement, egg laying, and viability. Neuron. 16 (5), 999-1009 (1996).
- Gönczy, P., et al. Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III. Nature. 408 (6810), 331-336 (2000).
- Miller, D. M., et al. elegans unc-4 gene encodes a homeodomain protein that determines the pattern of synaptic input to specific motor neurons. Nature. 355, 841-845 (1992).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N. Mutations in the Caenorhabditis elegans unc-4 gene alter the synaptic input to ventral cord motor neurons. Nature. 355, 838-841 (1992).
- Johnson, N. M., Behm, C. A., Trowell, S. C. Heritable and inducible gene knockdown in C. elegans using Wormgate and the ORFeome. Gene. 359, 26-34 (2005).
- Wani, K. A., et al. D1 dopamine receptor signaling is modulated by the R7 RGS protein EAT-16 and the R7 binding protein RSBP-1 in Caenoerhabditis elegans motor neurons. PLoS One. 7 (5), e37831 (2012).
- Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. RNAi screening to identify postembryonic phenotypes in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3442 (2012).
