Büyük ölçekli Gen demonte olarak<em> C. elegans</em> Sağlam Kayıp fonksiyon-fenotipleri oluşturmak için DsRNA Besleme Kitaplıklar kullanma
Summary
DsRNA C. beslerken elegans büyük ölçekli besleme ekranlar için geçerli protokoller değişken devirme verimleri elde gen fonksiyonunu değerlendirmek için güçlü bir araçtır. Bu gen ifadesinin oldukça etkili ve yeniden üretilebilir bir devirme ile sonuçlanan büyük ölçekli RNAi besleme ekranları yerine getirmek için geliştirilmiş bir protokol açıklar.
Abstract
DsRNAlar ifade solucanlar bakterileri besleyerek RNA girişim C gen fonksiyonunu değerlendirmek için yararlı bir araç olmuştur elegans. Genlerin küçük bir sayıda demonte için hedeflenen bu stratejisi iyi çalışıyor olsa da, büyük ölçekli besleme ekranları kendi programını sınırlar, değişken knockdown verimliliğini gösterir. Daha önce yayınlanan RNAi yok etme protokolleri deconstructed ve indirgenmiş Nakavt birincil kaynağı hayvanlara beslenen bakterilerden dsRNA kodlayan plazmidlerin kaybına bağlı olabilir bulduk. Bu gözlemlere dayanarak, biz büyük ölçüde azaltır veya verimli, yüksek verim elde etmek için demonte plazmid kaybı ortadan kaldıran bir DsRNA besleme protokol geliştirdik. Biz bu protokol C. aşağı sağlam, tekrarlanabilir darbe üretecek olduğunu göstermek nöronlar elegans da dahil olmak üzere çok sayıda doku türleri içinde, genler, ve büyük ölçekli ekranlarında etkili demonte izin verecektir. Bu protokol, bir ticari olarak temin edilebilir besleme dsRNA kullanankütüphane ve kütüphane çoğaltmak ve DsRNA ekranları gerçekleştirmek için gereken tüm adımları açıklar. Protokol, bir karmaşık ekipman kullanımını gerektirmez ve bu nedenle herhangi bir C. tarafından yapılabilir laboratuvar elegans.
Introduction
C. Tarihsel olarak, genetik ekranlar elegans DNA içinde rasgele mutasyona oluşturmak için, örneğin etil metansülfonat gibi bir kimyasal mutajen ile hayvanların tedavi edilmesi ile gerçekleştirilmiştir. Mutagenize edilmiş hayvanların soyu veya grandprogeny sonra sergilediğini arzu edilen bir anormal bir fenotip izole edilir. Fenotipe neden sorumlu mutasyon daha sonra bir emek-yoğun bir eşleme prosedürü ile ya da mutant solucan tüm genom sekanslama ile tanımlanır. Orada, kazanım fonksiyon-of ve zarar fonksiyon-fenotipler neden olabilir solucan genomu içinde kalıcı lezyonlar oluşturmak gibi kimyasal mutagenez ekranlar performans için pek çok avantajı vardır, ancak eşleme prosedürü yavaş ve pahalıdır.
Çift kollu bir RNA girişimi (dsRNAi) önemli biyolojik proseslerde yer alan genleri tanımlamak için alternatif bir yol sağlar. Bu yöntemde, bir endojen genin kodlama dizisi eşleşen dsRNA solucan sokulur.DsRNA kılavuzları yok 1 için onları hedef, uygun endojen mRNA bulmak ve bağlamak üzere görev küçük (21-22 nükleotid) RNA'ları oluşturmak için in vivo olarak işlenir. Bu prosedür nispeten hızlı olduğunu, ancak dsRNA'nın yerine DNA'dan daha mRNA hedefleri nedeniyle, sadece azaltma fonksiyon-fenotipleri bu yaklaşımı kullanılarak gözlenmiştir.
Bir hayvana dsRNA'lar sokulması dsRNA 3 hayvanları ıslatarak ya da 4 dsRNA eksprese hayvan bakteri beslenmesiyle, dsRNA 2 direkt enjeksiyonu ile elde edilebilir. Hayvanın en hücreleri SID-1, 5 dsRNA'yı ithal edebilen bir transmembran kanalı ifade olarak bu teslim yöntemlerin her sistemik devirme etkilere neden olabilir. Başlangıçta her seferinde tek tek genlerin ekspresyonunu bir demonte bir karşıt genetik yaklaşım olarak, iki besleme kütüphanelerinin oluşturulmasına şimdi büyük ölçekli genetik ekranlar izin verir. Piyasada bulunan DsRNA kütüphaneleri ba içerirlerTüm C.% 55 veya% 87 ya da temsil cterial klonlar elegans genleri 6, 7.
Ne yazık ki, büyük ölçekli dsRNAi besleme ekranlar genellikle değişken devirme verimliliği 8-10 sonuçlanabilir. RNAi Nakavt mutlak seviyesi kolaylıkla ölçülebilir olmasa da, büyük ölçekli ekranlar gözlenen etkinlik yok etme, indirgenmiş RNAi tarafından bozulmasını kaçış kalıntı gene özgü mRNA neden olmalıdır. Bu da, bu ekranlarında hayvanlara yem bakterilerden dsRNA plasmid kaybı doğrudan bir sonucu olabilir. Demonte etkileri beslenen hayvanlara 11 kontrol ile karşılaştırıldığında (eğer varsa) bu fikri desteklemek, hayvanlar bakterinin sadece% 50 bir hedef gene karşı dsRNA'lar ifade ettiği, bakteri karışımları beslenen, önemli ölçüde azalır göstermektedir. C. çoğu genler olarak dsRNAi ekranlarında yaparken gen Nakavt ölçüde kritik bir endişe olur elegans haplosufficient ve böylece gen tanımı, en az% 50 t azaltılmalıdıro kayıp fonksiyon-12 fenotip neden olur.
Biz büyük ölçekli ekranlar gerçekleştirmek için daha önceden yayınlanmış besleme protokolleri ve diğerleri 8-10 tarafından bildirilen aynı değişken devirme etkileri bulduk. Olası nedenler için bir arama, biz ekranda hayvanlara beslenen bakterilerin yaklaşık% 60 dsRNA'nın plazmid kaybetmişti bulundu. Biz dramatik azaltır veya ortadan kaldırır plazmid kaybı ve büyük ölçüde devirme etkinliğini arttırır kütüphane çoğaltma ve tarama protokolü geliştirdik. Bu protokol C de büyük ölçekli ekranlar yapmak için uygundur elegans ve ticari olarak temin edilebilen dsRNA kitaplıkları birini ya da taranması için kullanılabilir. Bu protokolü kullanarak, ekrana sırasında hayvanların beslenen bakterilerin esasen% 100 dsRNA kodlayan plazmid korumak ve, incelenen tüm dokularda işlev fenotipleri sağlam ve yüksek nüfuz kaybına yol bulmak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz C. büyük ölçekli ekranlar gerçekleştirmek için piyasada mevcut DsRNA besleme kitaplığı kullanan bir protokol tanımlanmıştır elegans. Biz kütüphane çoğaltmak ve etkili bir şekilde kullanmak için tüm talimatları sağlar. Bu yaklaşım, hayvanın farklı dokularda farklı biyolojik proseslerde yer alan genleri tanımlamak mümkün olduğunu göstermektedir. Burada tarif fenotipleri (UNC, Egl ve dpy) kolayca gözlemlenebilir olsa da, bu protokol, hemen hemen herhangi bir biyolojik…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Sağlık MH097163 National Institutes fonları tarafından desteklenmiştir. Bazı suşlar Araştırma Altyapı Programları NIH Ofisi (P40-OD010440) tarafından finanse CGC tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Reagent/Material | |||
| 96-well Falcon flat bottom plate | Fisher Scientific | 353072 | sterile |
| adhesive foil | USA Scientific | 2923-0100 | |
| Nunc omniplate | Fisher Scientific | 267060 | |
| 2.0 ml deep 96-well polypropylene Masterblock | USA Scientific | 5678-0285 | autoclavable |
| Lids for deep well plates | USA Scientific | 5665-6101 | |
| 50 ml combitips | USA Scientific | 4796-5000 | individually wrapped |
| Reservoir | USA Scientific | 2977-8500 | autoclavable |
| 12-well plates | USA Scientific | CC7682-7512 | individually wrapped |
| dsRNA feeding library | OpenBiosystems | RCE1181 | store -80 °C |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Tetracycline | Fisher Scientific | BP912-100 | |
| Carbenicillin | allow 2-4 weeks for delivery www.biochemicaldirect.com | ||
| Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A | Affymetrix | 10906 | for worm plates |
| Equipment | |||
| Brayer roller | USA Scientific | 9127-2940 | |
| Boekel 96-pin replicator | Fisher Scientific | 05-450-9 | autoclavable |
| microshaker | Thomas Scientific | 1231A93 | 3 mm orbit |
| 12 channel multichannel pipet (0.5-10 μl) | USA Scientific | 7112-0510 | |
| 12 channel multichannel pipet (30-300 μl) | USA Scientific | 7112-3300 | |
| Repeater Plus manual pipettor | USA Scientific | 4026-0201 |
Riferimenti
- Mello, C. C., Conte, D. Revealing the world of RNA interference. Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282 (5388), 430-431 (1998).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Jose, A. M., Smith, J. J., Hunter, C. P. Export of RNA silencing from C. elegans tissues does not require the RNA channel SID-1. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2283-2288 (2009).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
- Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).
- Simmer, F., et al. Genome-wide RNAi of C. elegans using the hypersensitive rrf-3 strain reveals novel gene functions. PLoS Biol. 1, 77-84 (2003).
- Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat. Genet. 33 (1), 40-48 (2003).
- Sieburth, D., et al. Systematic analysis of genes required for synapse structure and function. Nature. 436 (7050), 510-517 (2005).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), (2001).
- Hodgkin, J. Karyotype, ploidy, and gene dosage. WormBook. , 1-9 (2005).
- Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).
- Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436 (7050), 593-597 (2005).
- Lackner, M. R., Nurrish, S. J., Kaplan, J. M. Facilitation of synaptic transmission by EGL-30 Gqalpha and EGL-8 PLCbeta: DAG binding to UNC-13 is required to stimulate acetylcholine release. Neuron. 24 (2), 335-346 (1999).
- Bastiani, C. A., Gharib, S., Simon, M. I., Sternberg, P. W. Caenorhabditis elegans Galphaq regulates egg-laying behavior via a PLCbeta-independent and serotonin-dependent signaling pathway and likely functions both in the nervous system and in muscle. Genetica. 165 (4), 1805-1822 (2003).
- Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. J. Neurosci. 21 (6), 2001-2014 (2001).
- Terami, H., et al. Genomic organization, expression, and analysis of the troponin C gene pat-10 of Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 146 (1), 193-202 (1999).
- Novelli, J., Page, A. P., Hodgkin, J. The C terminus of collagen SQT-3 has complex and essential functions in nematode collagen assembly. Genetica. 172 (4), 2253-2267 (2006).
- Brundage, L., et al. Mutations in a C. elegans Gqalpha gene disrupt movement, egg laying, and viability. Neuron. 16 (5), 999-1009 (1996).
- Gönczy, P., et al. Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III. Nature. 408 (6810), 331-336 (2000).
- Miller, D. M., et al. elegans unc-4 gene encodes a homeodomain protein that determines the pattern of synaptic input to specific motor neurons. Nature. 355, 841-845 (1992).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N. Mutations in the Caenorhabditis elegans unc-4 gene alter the synaptic input to ventral cord motor neurons. Nature. 355, 838-841 (1992).
- Johnson, N. M., Behm, C. A., Trowell, S. C. Heritable and inducible gene knockdown in C. elegans using Wormgate and the ORFeome. Gene. 359, 26-34 (2005).
- Wani, K. A., et al. D1 dopamine receptor signaling is modulated by the R7 RGS protein EAT-16 and the R7 binding protein RSBP-1 in Caenoerhabditis elegans motor neurons. PLoS One. 7 (5), e37831 (2012).
- Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. RNAi screening to identify postembryonic phenotypes in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3442 (2012).
