Isolamento di tessuto adiposo cellule immunitarie
Summary
Il tessuto adiposo (AT) è un sito di attivazione delle cellule immunitarie intensa e interazione. Quasi tutte le cellule del sistema immunitario sono presenti in AT e per i rapporti sono alterati da obesità. Isolamento adeguato, quantificazione e caratterizzazione di AT popolazioni di cellule immunitarie sono fondamentali per comprendere il loro ruolo nella malattia immunometabolic.
Abstract
La scoperta di una maggiore infiltrazione di macrofagi nel tessuto adiposo (AT) di roditori obesi e gli esseri umani ha portato ad un intensificarsi di interesse contributo delle cellule immunitarie all'insulina locale e sistemica di resistenza. Isolamento e quantificazione delle diverse popolazioni di cellule immunitarie nel magri e obesi AT è oggi una tecnica comunemente utilizzata nei laboratori immunometabolism; ancora estrema cura deve essere presa sia in stromale isolamento delle cellule vascolari e nella analisi di citometria a flusso in modo che i dati ottenuti siano affidabili e interpretabile . In questo video mostriamo come per tritare, digerire, e isolare la frazione di cellule vascolari-arricchito stromale immune. Successivamente, mostriamo come anticorpi etichetta macrofagi e linfociti T e come correttamente cancello su di loro in esperimenti di citometria a flusso. Sono forniti di flusso rappresentativi citometria trame di basso contenuto di grassi alimentati magra e ricca di grassi nutriti topi obesi. Un elemento critico di questa analisi è l'uso di anticorpi che fannoNon fluorescenza nei canali dove AT macrofagi sono naturalmente autofluorescenti, così come l'uso di controlli di compensazione adeguati.
Introduction
Storicamente, il tessuto adiposo (AT) è stato visto come un organo inerte di stoccaggio dei lipidi, che si espande e si contrae in risposta al bilancio energetico. Ora capiamo che AT rappresenta un organo endocrino dinamica che secerne attivamente una serie di ormoni che influenzano direttamente il comportamento alimentare e l'omeostasi del glucosio sistemico. Inoltre, negli ultimi dieci anni c'è stato un crescente apprezzamento per le numerose popolazioni di cellule immunitarie che risiedono nella AT frazione stromale vascolare (SVF), così come il loro contributo alla AT omeostasi.
La possibilità di separare la AT adipociti e SVF utilizzando un collagenasi digest seguita da centrifugazione differenziale è stato descritto da Rodbell nel 1964 1. Collagenasi II è più spesso utilizzato per la separazione degli adipociti e SVF a causa di manutenzione di adipociti recettori dell'insulina 1. All'inizio, frazionamento enzimatica di AT è stato principalmente impiegato per studiare adipocyte metabolismo e per isolare preadipocytes. Più recentemente, questa tecnica, combinata con l'ampia disponibilità di citofluorimetri e il numero sempre crescente di anticorpi coniugati fluoroforo disponibili in commercio, ha facilitato la caratterizzazione di AT cellule immunitarie.
Sebbene la presenza di cellule immunitarie nella infiammato AT era stato descritto in precedenza 2, gli articoli fondamentali per Weisberg et al. e Xu et al. pubblicato nel 2003, furono i primi a documentare l'accumulo di AT macrofagi (ATM) in obesità, che secernono citochine infiammatorie e correlare con AT-specifica e sistemica insulino-resistenza 3,4. Queste osservazioni hanno fornito la base di un nuovo campo di indagine recentemente coniato, "immunometabolism," 5 e sono state seguite da studi che implicano varie popolazioni di cellule immunitarie, comprese le cellule dendritiche 6, mastociti, cellule T 7 8 –10, cellule B, cellule NKT 11 12 13, eosinofili e neutrofili 14,15 nello sviluppo dell'obesità associata resistenza all'insulina.
L'obiettivo di questo articolo è di fornire una descrizione dettagliata della tecnica digest collagenasi utilizzata per isolare le cellule del AT SVF e caratterizzare bancomat e AT cellule T mediante citometria a flusso. Questo protocollo è stato ottimizzato per mouse, tuttavia, gli spettatori possono trarre beneficio dalla lettura di un ottimo articolo che fornisce ampi dettagli sulla ottimizzazione di questa tecnica per l'uomo a 16 anni. I destinatari di questo articolo include investigatori con limitata esperienza di lavoro con il mouse e l'esecuzione di citometria a flusso. Diverse considerazioni pratiche per il bilanciamento resa cellulare e la vitalità con il tempo e le risorse sono presentate così come controlli di citometria a flusso ottimali per la caratterizzazione di AT popolazioni di cellule immunitarie. Oltre al nostro protocollo, i lettori sono referred un recente articolo JoVE da Basu et al. per una eccellente discussione di alcuni aspetti tecnici della citometria a flusso per comprendere adeguati controlli e compensazioni 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Crescente interesse per il ruolo del sistema immunitario nelle conseguenze metaboliche dell'obesità ha portato all'uso diffuso di citometria a flusso per caratterizzare cellule immunitarie del AT. Anche se il protocollo esatto varierà tra laboratori sulla base della loro esperienza e le attrezzature disponibili, i passaggi critici includono collagenasi digestione, centrifugazione differenziale, e la cellula antigene di superficie di etichettatura. Lo scopo del presente articolo è di fornire un protocollo dett…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
OCS è supportato da un NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), AK è sostenuto da una borsa di studio post-dottorato dalla American Diabetes Association (7-10-MI-05), e AHH è supportato da un American Heart Association Investigator Award Fondata (12EIA8270000). Esperimenti di citometria a flusso sono stati eseguiti nel VMC Citometria a Flusso risorsa condivisa. Il VMC Citometria a Flusso risorsa condivisa è supportata dalla Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).
Materials
| Name | Company | Catalog # | |
| DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| collagenase | Sigma | C6885-5G | |
| propidium iodide solution | Sigma | P4864-10 ml | |
| stable stack 20 microliter | Rainin | SS-L10 | |
| 20 microliter filter tips | Rainin | SRL10F | |
| stable stack 250 microliter tips | Rainin | SS-L250 | |
| 1000 microliter tips | Rainin | GPS-L1000 | |
| 1000 microliter filter tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 250 microliter Filter Tips | Rainin | SR-L200F | |
| FC Block | BD Biosciences | 553142 | |
| fisher 100mn strainers | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| medium weigh dish | Fisherbrand | 02-202B | |
| aluminum foil | Fisherbrand | 1213100 | |
| mincing scissors | Fisherbrand | 089531B | |
| Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 14-959-49A | |
| filter top FACS tubes | BD Falcon | 352235 | |
| 10 ml pipette case 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 5 ml syringe | BD Falcon | 309646 | |
| V Bottom Plates | Costar | 07-200-107 | |
| transfer bulb pipette | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| Shaker | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| Adhesive mat | Thermo Scientific | 1368750 | |
| Cell Culture Centrifuge | Sorvall | 75253839 | |
| Adapters | Sorvall | 75003723 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Concentration: 0.5 – 1 μg/ 106 cells |
| Rat anti-mouse F4/80 | eBioscience | 17-4801 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321 |
| Rat anti-mouse CD11b | eBioscience | 11-0112 | Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031 |
| Armenian Hamster anti-mouse CD11c | eBioscience | 12-0114 | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88 |
| Goat anti-mouse MGL1/2 | R&D Systems | FAB4297P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Goat anti-mouse CD206 | R&D Systems | FAB2535P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Rat anti-mouse CCR2 | R&D Systems | FAB5538P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P |
| Armenian Hamster anti-mouse TCRβ | BD Biosciences | 553174 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956 |
| Rat anti-mouse CD8a | BD Biosciences | 552877 | Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784 |
| Rat anti-mouse CD4 | BD Biosciences | 557956 | Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963 |
Table 1. List of Materials and Reagents.
Riferimenti
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- Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue. Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).
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- Xu, H., et al. Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1821-1830 (2003).
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