Isolement de tissu adipeux cellules immunitaires
Summary
Le tissu adipeux (AT) est un site d'activation intense des cellules immunitaires et de l'interaction. Presque toutes les cellules du système immunitaire sont présents dans A et leurs rapports sont modifiés par l'obésité. Une bonne isolation, la quantification et la caractérisation des AT populations de cellules immunitaires sont essentielles pour la compréhension de leur rôle dans la maladie immunometabolic.
Abstract
La découverte de l'augmentation de l'infiltration des macrophages dans le tissu adipeux (AT) de rongeurs obèses et les humains a conduit à une intensification de l'intérêt de la contribution des cellules immunitaires à l'insulino-résistance locale et systémique. L'isolement et la quantification des différentes populations de cellules immunitaires dans minces et obèses AT est maintenant une technique couramment utilisée dans les laboratoires de immunometabolism; soins encore extrême doit être pris à la fois dans l'isolement des cellules vasculaires stromales et dans l'analyse de cytométrie en flux de sorte que les données obtenues sont fiables et interprétables . Dans cette vidéo, nous démontrons comment mâche, digérer, et d'isoler la fraction vasculaire enrichie en cellules stromales immunitaire. Par la suite, nous montrons comment les macrophages de l'étiquette d'anticorps et des lymphocytes T et la manière de porte correctement sur eux des expériences de cytométrie en flux. Représentant parcelles de cytométrie de flux de matières grasses nourris gras nourris obèses souris maigres et élevé sont fournis. Un élément essentiel de cette analyse est l'utilisation d'anticorps qui nepas de fluorescence dans les canaux où AT macrophages sont naturellement autofluorescente, ainsi que l'utilisation des contrôles de compensation appropriées.
Introduction
Historiquement, le tissu adipeux (AT) a été considéré comme un organe inerte de stockage des lipides, qui se dilate et se contracte en réaction à l'équilibre énergétique. Nous comprenons maintenant que AT représente un organe endocrine qui sécrète dynamique activement un certain nombre d'hormones, qui influent directement sur le comportement alimentaire et l'homéostasie du glucose systémique. En outre, au cours de la dernière décennie, il ya eu une appréciation croissante pour les nombreuses populations de cellules immunitaires résidant dans l'AT fraction stroma vasculaire (SVF), ainsi que leur contribution à AT homéostasie.
La capacité de séparer le AT adipocyte et SVF en utilisant une collagénase digest suivie par centrifugation différentielle a d'abord été décrit par Rodbell en 1964 1. Collagénase II est le plus souvent utilisé pour la séparation des adipocytes et SVF pour cause de maintenance de récepteurs de l'insuline des adipocytes 1. Dès le début, le fractionnement enzymatique de AT a été principalement utilisé pour étudier adipoCyte métabolisme et d'isoler les pré-adipocytes. Plus récemment, cette technique, combinée avec la large disponibilité des cytomètres et le nombre sans cesse croissant d'anticorps conjugué à un fluorophore disponibles dans le commerce, a facilité la caractérisation des cellules immunitaires AT.
Bien que la présence de cellules immunitaires dans enflammée AT avait été décrit précédemment 2, les articles fondateurs de Weisberg et al. et Xu et al. publié en 2003 furent les premiers à documenter l'accumulation de macrophages AT (GAB) dans l'obésité, qui sécrètent des cytokines inflammatoires et en corrélation avec la résistance à l'insuline AT-spécifique et systémique 3,4. Ces observations ont servi de base d'un nouveau champ d'investigation récemment inventé, "immunometabolism," 5 et ont été suivies par des études impliquant différentes populations de cellules immunitaires, dont les cellules dendritiques, les mastocytes 6 7, 8 cellules T –10, les cellules B, les cellules NKT 11 12 13, les éosinophiles, les neutrophiles et 14,15 dans le développement de l'obésité associée à une résistance à l'insuline.
Le but de cet article est de fournir une description détaillée de la technique digest collagénase utilisée pour isoler les cellules de la SVF AT et de caractériser les guichets automatiques et AT cellules T via la cytométrie de flux. Ce protocole a été optimisé pour les souris AT; toutefois, les téléspectateurs peuvent bénéficier de la lecture d'un excellent article fournissant de nombreux détails sur l'optimisation de cette technique pour l'homme à 16 ans. Le public cible de cet article comprend des enquêteurs ayant une expérience limitée de travail avec la souris à effectuer et cytométrie de flux. Plusieurs considérations pratiques pour équilibrer le rendement et la viabilité cellulaire avec le temps et les ressources sont présentées ainsi que des contrôles de cytométrie de flux optimales pour caractériser les populations de cellules immunitaires. En plus de notre protocole, les lecteurs sont referred à un article de JoVE récente par Basu et al. pour une excellente discussion de quelques-uns des aspects techniques de cytométrie en flux pour inclure des contrôles et des compensations adéquates 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'intérêt croissant pour le rôle du système immunitaire dans les conséquences métaboliques de l'obésité a conduit à l'utilisation généralisée de la cytométrie en flux pour caractériser les cellules immunitaires de l'AT. Bien que le protocole exact variera entre laboratoires basés sur leur propre expérience et de l'équipement disponible, les étapes essentielles comprennent digestion à la collagénase, centrifugation différentielle, et la surface des cellules antigène étiquetage. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JSO est soutenu par une NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), AK est soutenu par une bourse de recherche postdoctorale de l'American Diabetes Association (7-10-MI-05), et AHH est soutenu par une bourse de chercheur de l'American Heart Association Établi (12EIA8270000). expériences de cytométrie de flux ont été réalisées dans le MVC cytométrie en flux ressource partagée. Le MVC cytométrie en flux ressource partagée est soutenue par la Digestive Disease Research Center Vanderbilt (DK058404).
Materials
| Name | Company | Catalog # | |
| DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| collagenase | Sigma | C6885-5G | |
| propidium iodide solution | Sigma | P4864-10 ml | |
| stable stack 20 microliter | Rainin | SS-L10 | |
| 20 microliter filter tips | Rainin | SRL10F | |
| stable stack 250 microliter tips | Rainin | SS-L250 | |
| 1000 microliter tips | Rainin | GPS-L1000 | |
| 1000 microliter filter tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 250 microliter Filter Tips | Rainin | SR-L200F | |
| FC Block | BD Biosciences | 553142 | |
| fisher 100mn strainers | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| medium weigh dish | Fisherbrand | 02-202B | |
| aluminum foil | Fisherbrand | 1213100 | |
| mincing scissors | Fisherbrand | 089531B | |
| Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 14-959-49A | |
| filter top FACS tubes | BD Falcon | 352235 | |
| 10 ml pipette case 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 5 ml syringe | BD Falcon | 309646 | |
| V Bottom Plates | Costar | 07-200-107 | |
| transfer bulb pipette | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| Shaker | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| Adhesive mat | Thermo Scientific | 1368750 | |
| Cell Culture Centrifuge | Sorvall | 75253839 | |
| Adapters | Sorvall | 75003723 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Concentration: 0.5 – 1 μg/ 106 cells |
| Rat anti-mouse F4/80 | eBioscience | 17-4801 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321 |
| Rat anti-mouse CD11b | eBioscience | 11-0112 | Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031 |
| Armenian Hamster anti-mouse CD11c | eBioscience | 12-0114 | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88 |
| Goat anti-mouse MGL1/2 | R&D Systems | FAB4297P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Goat anti-mouse CD206 | R&D Systems | FAB2535P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Rat anti-mouse CCR2 | R&D Systems | FAB5538P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P |
| Armenian Hamster anti-mouse TCRβ | BD Biosciences | 553174 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956 |
| Rat anti-mouse CD8a | BD Biosciences | 552877 | Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784 |
| Rat anti-mouse CD4 | BD Biosciences | 557956 | Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963 |
Table 1. List of Materials and Reagents.
Riferimenti
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- Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue. Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).
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