Summary

Обнаружение соматических генетических изменений в опухолевых образцов экзоном улавливания и Massively Parallel Секвенирование

Published: October 18, 2013
doi:

Summary

Мы описывают получение штрих библиотек ДНК и последующей гибридизации на основе захвата экзона для обнаружения ключевых связанных с раком мутаций в клинических образцах опухолей по массовым параллелизмом секвенирования "следующего поколения". Целевые экзон последовательности предлагает преимущества высокой пропускной способности, низкой стоимости и глубокой покрытия последовательности, что позволит обеспечить высокую чувствительность для обнаружения низкие мутации частот.

Abstract

Усилия по выявлению и расследованию ключевые онкогенные мутации оказались ценными для облегчения соответствующее лечение для больных раком. Установление высокой пропускной, массовым параллелизмом последовательности "следующего поколения" помог открытие многих таких мутаций. Для повышения клинической и поступательное полезность этой технологии, платформы должны быть высокой пропускной, экономически эффективной, и совместимо с формалином фиксированной парафин (FFPE) образцы тканей, которые могут дать малое количество деградированных или поврежденной ДНК. Здесь мы описываем подготовку штрих и мультиплексированных библиотек ДНК с последующей гибридизацией на основе захвата целевых экзонов для обнаружения связанных с раком мутаций в свежезамороженных и FFPE опухолей по массовым параллелизмом секвенирования. Этот метод позволяет выявить мутации последовательности, скопируйте номер изменения, и выберите структурные перестройки с участием всех целевых генов. Целевые экзон последовательности предлагает тон приносит пользу высокой пропускной способности, низкой стоимости и глубокой покрытия последовательности, таким образом, присвоении высокой чувствительностью для обнаружения низкие мутации частот.

Introduction

Идентификация "водитель" опухолевых генетических событий в ключевых онкогенов и генов-супрессоров опухолей играет существенную роль в диагностике и лечении многих видов рака 1. Крупномасштабные научно-исследовательских работ, использующие массовым параллелизмом последовательности "следующего поколения", позволили выявить многих таких раковых генов, ассоциированных в последние годы 2. Тем не менее, эти платформы секвенирования как правило, требуют больших количеств ДНК, выделенные из свежезамороженных тканей, что создает серьезную проблему, при характеристике и анализа мутаций ДНК из сохранившихся тканей, таких как фиксированные формалином и залитые парафином (FFPE) образцов опухолей. Улучшенные усилия для эффективного и надежного характеризуют "действенные" геномной информации из образцов опухолевых FFPE позволит ретроспективный анализ ранее накренился образцов и далее поощрять индивидуальные подходы к лечению рака.

Традиционно, молекулярная гiagnostic лаборатории полагались на трудоемких, с низким уровнем пропускной методологий, таких как Sanger секвенирования и ПЦР в реальном времени для мутаций ДНК профилирования. Совсем недавно, методы выше пропускной использующие мультиплексированный ПЦР или масс-спектрометрический генотипирование были разработаны, чтобы исследовать текущие соматические мутации в ключевых генов рака 3-5. Эти подходы, однако, ограничиваются тем, что только predesignated "горячих точек" мутации анализировали, что делает их непригодными для обнаружения инактивирующие мутации в генах супрессоров опухолей. Солидная параллельная последовательность предлагает несколько преимуществ по сравнению с этих стратегий, включая возможность запрашивать целые экзоны для обоих распространенных и редких мутаций, возможность выявления дополнительных классов геномных изменений, таких как число копий прибылей и убытков, а также большей чувствительностью обнаружения в гетерогенных образцов 6, 7 . Всего секвенирование генома представляет собой наиболее комплексный подход к открытию мутации, хотя это относительнолы дорогой и несет большие вычислительные мощности для анализа и хранения данных.

Для клинического применения, где только небольшая часть генома могут представлять клинический интерес, два конкретных инновации в технологии последовательности были преобразующей. Во-первых, через гибридизации на основе захвата экзона, можно выделить ДНК, соответствующий ключевых связанных с раком генов целевой мутации профилирования 8,. Во-вторых, через перевязкой молекулярных штрих-кодов (т.е. последовательности ДНК 6-8 нуклеотидов в длину), можно объединить сотни образцов в секвенирования перспективе и полностью воспользоваться все возрастающей мощностью массовым параллелизмом инструментов секвенирования 10. В сочетании, эти нововведения позволяют опухоли для профилирования для более низкой стоимости и в более высокой пропускной способности, с меньшими вычислительными требованиями 11. Кроме того, путем перераспределения покрытие только последовательности этих генов наиболее важных для конкретного применения, можно достижимве большую глубину секвенирования повышенной чувствительностью обнаружения для низких событий частот аллелей.

Здесь мы опишем наше воздействие анализа (Integrated Мутация профилирования мишеней Осуществимое рака), которая использует захват экзона на штрих бассейнов библиотечных последовательность путем гибридизации с использованием пользовательских олигонуклеотиды, чтобы захватить все белок-кодирующих экзонов и выберите интронов из 279 ключевых раковых генов, ассоциированных (Таблица 1 ). Эта стратегия позволяет выявить мутации, вставкам, количество копию изменений и выберите структурные перестройки, связанные с эти 279 генов. Наш метод совместим с ДНК, выделенной из обоих свежезамороженной и FFPE ткани, а также мелких аспиратов игл и других цитологических образцов.

Protocol

1. ДНК и подготовке реагентов Примечание: Этот протокол описывает одновременную обработку и анализ 24 образцов (например, 12 опухолевые / нормальные пары), но могут быть адаптированы для малых и больших партий. Образцы ДНК может происходить от FFPE или свежезамороженной т…

Representative Results

Один бассейн из 24 библиотек штрих последовательности (12 опухолевые-нормальный пар) был взят в плен, используя зонды, соответствующие всем белок-кодирующих экзонов 279 генов рака и секвенировали, как 2 х 75 б.п. читает на одной полосе в проточной ячейке HiSeq 2000 года. Опухолевых и нормальных би?…

Discussion

Наша ВЛИЯНИЕ анализ производит высокую скорость выравнивания, высокую ставку по-цели, высокую целевую охват и высокую чувствительность для обнаружения мутаций, вставкам и скопировать номер изменения. Мы продемонстрировали способность нашего IMPACT анализе для последовательности ДНК и?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим доктора Агнес Виале и центральной лаборатории MSKCC геномики для технической помощи. Этот протокол был разработан при поддержке Бин онкологический научный центр Джеффри и Фермер Семейства.

Materials

NEBNext End Repair Module New England Biolabs E6050L
NEBNext dA-Tailing Module New England Biolabs E6053L
NEBNext Quick Ligation Module New England Biolabs E6056L
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter Genomics
NEXTflex PCR-Free Barcodes – 24 Bioo Scientific 514103
HiFi Library Amplification Kit KAPA Biosystems KK2612
COT Human DNA, Fluorometric Grade Roche Diagnostics 05 480 647 001
NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit Roche NimbleGen 05 634 261 001
SeqCap EZ Library Baits Roche NimbleGen
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit Life Technologies Q32850
Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit Life Technologies Q32851
Agilent DNA HS Kit Agilent Technologies 5067-4626, 4627
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies
Covaris E220 Covaris
Magnetic Stand-96 Ambion AM10027
Illumina Hi-Seq 2000 Illumina

References

  1. Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
  2. Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat. Rev. Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
  3. Thomas, R. K., Baker, A. C., Debiasi, R. M., et al. High-throughput oncogene mutation profiling in human cancer. Nat. Genet. 39 (3), 347-351 (2007).
  4. Macconaill, L. E., Campbell, C. D., Kehoe, S. M., et al. Profiling critical cancer gene mutations in clinical tumor samples. PLoS One. 4 (11), e7887 (2009).
  5. Dias-Santagata, D., Akhavanfard, S., David, S. S., et al. Rapid targeted mutational analysis of human tumours: a clinical platform to guide personalized cancer medicine. EMBO Mol. Med. 2 (5), 146-158 (2010).
  6. Macconaill, L. E., Van Hummelen, P., Meyerson, M., Hahn, W. C. Clinical implementation of comprehensive strategies to characterize cancer genomes: opportunities and challenges. Cancer Discov. 1 (4), 297-311 (2011).
  7. Taylor, B. S., Ladanyi, M. Clinical cancer genomics: how soon is now. J. Pathol. 223 (2), 318-326 (2011).
  8. Gnirke, A., Melnikov, A., Maguire, J., et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nat. Biotechnol. 27 (2), 182-189 (2009).
  9. Mamanova, L., Coffey, A. J., Scott, C. E., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nat. Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
  10. Craig, D. W., Pearson, J. V., Szelinger, S., et al. Identification of genetic variants using bar-coded multiplexed sequencing. Nat. Methods. 5 (10), 887-893 (2008).
  11. Wagle, N., Berger, M. F., Davis, M. J., et al. High-throughput detection of actionable genomic alterations in clinical tumor samples by targeted, massively parallel sequencing. Cancer Discov. 2 (1), 82-93 (2012).
  12. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  13. Depristo, M. A., Banks, E., Poplin, R., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nat. Genet. 43 (5), 491-498 (2011).
  14. Robinson, J. T., Thorvaldsdottir, H., Winckler, W., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
  15. Cibulskis, K., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat. Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).
  16. Larson, D. E., Harris, C. C., Chen, K., et al. SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data. Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).
  17. Saunders, C. T., Wong, W. S., Swamy, S., Becq, J., Murray, L. J., Cheetham, R. K. Strelka: Accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).
  18. Albers, C. A., Lunter, G., Macarthur, D. G., Mcvean, G., Ouwehand, W. H., Din del Durbin, R. Accurate indel calls from short-read data. Genome Res. 21 (6), 961-973 (2011).
  19. Li, S., Li, R., Li, H., et al. Efficient identification of indels from short paired reads. Genome Res. 23 (1), 195-200 (2013).
  20. Sindi, S., Helman, E., Bashir, A., Raphael, B. J. A geometric approach for classification and comparison of structural variants. Bioinformatics. 25 (12), 222-230 (2009).
  21. Chen, K., Wallis, J. W., Mclellan, M. D., et al. BreakDancer: an algorithm for high-resolution mapping of genomic structural variation. Nat. Methods. 6 (9), 677-681 (2009).
  22. Wang, J., Mullighan, C. G., Easton, J., et al. CREST maps somatic structural variation in cancer genomes with base-pair resolution. Nat. Methods. 8 (8), 652-654 (2011).
  23. Drier, Y., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Somatic rearrangements across cancer reveal classes of samples with distinct patterns of DNA breakage and rearrangement-induced hypermutability. Genome Res. 23 (2), 228-235 (2012).
  24. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  25. Roychowdhury, S., Iyer, M. K., Robinson, D. R., et al. Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study. Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).
  26. Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity. BMC Med. Genomics. 4, 68 (2011).
check_url/50710?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Won, H. H., Scott, S. N., Brannon, A. R., Shah, R. H., Berger, M. F. Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing. J. Vis. Exp. (80), e50710, doi:10.3791/50710 (2013).

View Video