Detecteren Somatische genetische veranderingen in tumorspecimens door Exon Capture en Massively Parallel Sequencing
Summary
We beschrijven de bereiding van barcode DNA-bibliotheken en daaropvolgende hybridisatie gebaseerde exon vastleggen voor de detectie van de belangrijkste kanker-geassocieerde mutaties in klinische monsters tumor door massaal parallelle "next generation" sequencing. Gerichte exon sequentie biedt de voordelen van hoge doorvoer, lage kosten en diepe sequentie dekking, hetgeen aldus hoge gevoeligheid voor het detecteren van lage frequentie mutaties.
Abstract
Inspanningen om belangrijke oncogene mutaties op te sporen en te onderzoeken zijn waardevol voor de juiste behandeling voor kankerpatiënten vergemakkelijken bewezen. De oprichting van high-throughput, heeft massaal parallelle 'next-generation' sequencing de ontdekking van veel van dergelijke mutaties geholpen. De klinische en translationele nut van deze techniek verbeteren, moeten platforms high-throughput, kosteneffectieve en compatibel met formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde (FFPE) weefselmonsters dat kleine hoeveelheden van aangetaste of beschadigde DNA kan verkregen worden. Hier beschrijven we de bereiding van barcodes en gemultiplexte DNA-bibliotheken gevolgd door hybridisatie gebaseerde vastlegging van gerichte exons voor de detectie van kanker-geassocieerde mutaties in vers bevroren of FFPE tumoren door massaal parallelle sequencing. Deze methode maakt de identificatie van sequentie mutaties, aantal kopieën wijzigingen, en selecteer structurele herschikkingen waarbij alle gerichte genen. Gerichte exon sequencing biedt tHij profiteert van high throughput, lage kosten, en diep volgorde dekking, waardoor het verlenen van hoge gevoeligheid voor het detecteren van lage frequentie mutaties.
Introduction
De identificatie van "bestuurder" tumor genetische gebeurtenissen in de belangrijkste oncogenen en tumor suppressor genen speelt een essentiële rol in de diagnose en behandeling van vele vormen van kanker 1. Grootschalige onderzoeksinspanningen gebruik te maken van massively parallel "next-generation" sequencing hebben de identificatie van veel van dergelijke kanker-geassocieerde genen in de afgelopen jaren 2 ingeschakeld. Echter, deze sequentie platformen vereisen typisch grote hoeveelheden DNA geïsoleerd uit vers bevroren weefsel en die een belangrijke beperking bij het karakteriseren en analyseren van DNA-mutaties van geconserveerde weefsels, zoals formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) tumormonsters. Verbeterde inspanningen om "bruikbare" genomische informatie efficiënt en betrouwbaar karakteriseren van FFPE tumorsteekproeven zal de retrospectieve analyse van eerder overbanked exemplaren mogelijk te maken en verder geïndividualiseerde aanpak bij kanker het management aan te moedigen.
Traditioneel, moleculaire diagnostic laboratoria hebben vertrouwd op tijdrovende, low-throughput methodologieën zoals Sanger sequencing en real-time PCR voor DNA-mutatie profilering. Meer recent zijn hogere doorvoer werkwijzen die gebruik multiplex PCR of massaspectrometrische genotypering ontwikkeld om terugkerende somatische mutaties in belangrijke kankergenen 3-5 onderzoeken. Deze benaderingen zijn echter beperkt doordat alleen vooraf toegewezen "hotspot" mutaties worden getest, waardoor ze ongeschikt voor het detecteren van inactiverende mutaties in tumorsuppressorgenen. Massaal parallelle sequencing biedt verschillende voordelen boven deze strategieën waaronder het vermogen om hele exons ondervragen voor zowel de gemeenschappelijke en zeldzame mutaties, de mogelijkheid om extra soorten genomic veranderingen zoals kopieaantal winsten en verliezen worden vastgesteld en grotere gevoeligheid in heterogene monsters 6, 7 . Whole genome sequencing vertegenwoordigt de meest uitgebreide aanpak voor mutatie ontdekking, al is het relatiefly duur en loopt grote computationele eisen voor data-analyse en opslag.
Voor klinische toepassingen, waarbij slechts een klein deel van het genoom van klinisch belang zijn, hebben twee specifieke innovaties sequencing technologie transformerende geweest. Eerste, door middel van hybridisatie gebaseerde exon vastleggen, kan men isoleren DNA overeenkomt met de belangrijkste kanker-geassocieerde genen voor gerichte mutatie profilering 8. Ten tweede, door ligatie van moleculaire barcodes (dwz DNA-sequenties 6-8 nucleotiden lang), kan men honderden monsters per sequencing run bundelen en volledig te profiteren van de steeds toenemende capaciteit van massively parallel sequencing instrumenten 10. In combinatie zijn deze technieken ervoor tumoren worden geprofileerd voor lagere kosten en hogere doorvoer, met kleinere berekeningsvereisten 11. Verder, door een herverdeling opeenvolging dekking uitsluitend genen meest kritisch voor de specifieke toepassing, kan men Achieve grotere sequencing diepte voor een hogere gevoeligheid voor lage allelfrequentie evenementen.
Hier beschrijven we onze IMPACT test (Integrated Mutation Profileren van Actionable Cancer Doelen), die exon capture gebruikt op barcode sequentiebibliotheek zwembaden door hybridisatie met aangepaste oligonucleotiden alle eiwit-coderende exons vastleggen en selecteer introns van 279 belangrijkste kanker-geassocieerde genen (tabel 1 ). Deze strategie maakt de identificatie van mutaties, indels, kopij-aantal variaties, en selecteer structurele herschikkingen waarbij deze 279 genen. Onze methode is compatibel met DNA geïsoleerd uit zowel vriesverse en FFPE weefsel evenals naaldopzuigingen en andere cytologie exemplaren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Onze IMPACT test produceert een hoge uitlijning, hoge on-target rate, high beoogde dekking en een hoge gevoeligheid voor het opsporen van mutaties, indels, en kopieer aantal veranderingen. We hebben het vermogen van onze IMPACT test aangetoond sequentie DNA van zowel vriesverse en gearchiveerd FFPE monsters van lage DNA-ingang. Door het uitvoeren van gerichte exon sequencing van de belangrijkste kanker-geassocieerde genen, kan men zeer diep volgorde dekking te bereiken voor de exons van deze meest kritieke genen waardoo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken dr. Agnes Viale en de MSKCC Genomics Core Laboratorium voor technische ondersteuning. Dit protocol werd ontwikkeld met steun van de Geoffrey Beene Cancer Research Center en de Stichting Farmer Family.
Materials
| NEBNext End Repair Module | New England Biolabs | E6050L | |
| NEBNext dA-Tailing Module | New England Biolabs | E6053L | |
| NEBNext Quick Ligation Module | New England Biolabs | E6056L | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | ||
| NEXTflex PCR-Free Barcodes – 24 | Bioo Scientific | 514103 | |
| HiFi Library Amplification Kit | KAPA Biosystems | KK2612 | |
| COT Human DNA, Fluorometric Grade | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 | |
| NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 | |
| SeqCap EZ Library Baits | Roche NimbleGen | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Agilent DNA HS Kit | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| Covaris E220 | Covaris | ||
| Magnetic Stand-96 | Ambion | AM10027 | |
| Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |
References
- Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
- Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat. Rev. Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
- Thomas, R. K., Baker, A. C., Debiasi, R. M., et al. High-throughput oncogene mutation profiling in human cancer. Nat. Genet. 39 (3), 347-351 (2007).
- Macconaill, L. E., Campbell, C. D., Kehoe, S. M., et al. Profiling critical cancer gene mutations in clinical tumor samples. PLoS One. 4 (11), e7887 (2009).
- Dias-Santagata, D., Akhavanfard, S., David, S. S., et al. Rapid targeted mutational analysis of human tumours: a clinical platform to guide personalized cancer medicine. EMBO Mol. Med. 2 (5), 146-158 (2010).
- Macconaill, L. E., Van Hummelen, P., Meyerson, M., Hahn, W. C. Clinical implementation of comprehensive strategies to characterize cancer genomes: opportunities and challenges. Cancer Discov. 1 (4), 297-311 (2011).
- Taylor, B. S., Ladanyi, M. Clinical cancer genomics: how soon is now. J. Pathol. 223 (2), 318-326 (2011).
- Gnirke, A., Melnikov, A., Maguire, J., et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nat. Biotechnol. 27 (2), 182-189 (2009).
- Mamanova, L., Coffey, A. J., Scott, C. E., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nat. Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
- Craig, D. W., Pearson, J. V., Szelinger, S., et al. Identification of genetic variants using bar-coded multiplexed sequencing. Nat. Methods. 5 (10), 887-893 (2008).
- Wagle, N., Berger, M. F., Davis, M. J., et al. High-throughput detection of actionable genomic alterations in clinical tumor samples by targeted, massively parallel sequencing. Cancer Discov. 2 (1), 82-93 (2012).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Depristo, M. A., Banks, E., Poplin, R., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nat. Genet. 43 (5), 491-498 (2011).
- Robinson, J. T., Thorvaldsdottir, H., Winckler, W., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Cibulskis, K., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat. Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).
- Larson, D. E., Harris, C. C., Chen, K., et al. SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data. Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).
- Saunders, C. T., Wong, W. S., Swamy, S., Becq, J., Murray, L. J., Cheetham, R. K. Strelka: Accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).
- Albers, C. A., Lunter, G., Macarthur, D. G., Mcvean, G., Ouwehand, W. H., Din del Durbin, R. Accurate indel calls from short-read data. Genome Res. 21 (6), 961-973 (2011).
- Li, S., Li, R., Li, H., et al. Efficient identification of indels from short paired reads. Genome Res. 23 (1), 195-200 (2013).
- Sindi, S., Helman, E., Bashir, A., Raphael, B. J. A geometric approach for classification and comparison of structural variants. Bioinformatics. 25 (12), 222-230 (2009).
- Chen, K., Wallis, J. W., Mclellan, M. D., et al. BreakDancer: an algorithm for high-resolution mapping of genomic structural variation. Nat. Methods. 6 (9), 677-681 (2009).
- Wang, J., Mullighan, C. G., Easton, J., et al. CREST maps somatic structural variation in cancer genomes with base-pair resolution. Nat. Methods. 8 (8), 652-654 (2011).
- Drier, Y., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Somatic rearrangements across cancer reveal classes of samples with distinct patterns of DNA breakage and rearrangement-induced hypermutability. Genome Res. 23 (2), 228-235 (2012).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Roychowdhury, S., Iyer, M. K., Robinson, D. R., et al. Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study. Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).
- Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity. BMC Med. Genomics. 4, 68 (2011).
