Akut lösemi tedavisi için Tirosin Kinaz İnhibitörleri klinik öncesi değerlendirilmesi
Summary
Reseptör tirozin kinazlar, ektopik bir çok kanser olarak ifade edilmiştir ve akut lösemi terapötik hedefler olarak tespit edilmiştir. Bu makale, akut lösemi tedavisinde tirosin kinaz inhibitörlerinin klinik öncesi değerlendirilmesi için etkin bir strateji tarif etmektedir.
Abstract
Reseptör tirozin kinazlar, lösemi ve katı tümörlerin her ikisi de dahil olmak üzere birçok kanser gelişimi ve ilerlemesi implike edilmiştir, ve çekici druggable tedavi hedeflerdir. Burada akut lösemi tedavisinde tirosin kinaz inhibitörleri (TKIs) klinik öncesi değerlendirilmesi için etkin bir dört aşamalı bir strateji tarif eder. Başlangıçta, western blot analizi kültürlenmiş lösemi hücrelerinde hedef inhibisyon doğrulamak için kullanılır. Fonksiyonel aktivite bu metilselüloz ya da yumuşak agar kültürlerde klonojenik tahliller kullanılarak değerlendirilir. Hücre kültürü deneylerinde etkisini gösteren deney bileşikleri, insan lösemi hücre hatları ile ortotopikal NOD-SCID-gamma (NTG) fare kullanılarak in vivo olarak değerlendirilir. İlk in vivo farmakodinamik çalışmalar kemik iliğinden izole lösemik patlamalarda hedef önlenmesini değerlendirecek. Bu yaklaşım, etkin bir hedef inhibit için gerekli uygulama doz ve programın saptanması için kullanılıriyon. Daha sonraki çalışmalar, bu şekilde, bir in vivo görüntüleme sistemi kullanılarak bio-ışıldama lösemi yükü ve terapötik yanıtın değerlendirilmesi non-invazif biyolüminesans izleme sağlayan, lusiferazı ifade eden lösemi hücreleri kullanılarak in vivo TKIs etkinliğini değerlendirmek. Bu strateji, in vitro ve in vivo olarak TKIs değerlendirilmesi için etkili olmuştur ve tedavi edici potansiyele sahip moleküler hedefli maddelerin tanımlanması için veya birden fazla bileşiklerinin doğrudan karşılaştırılması ve öncelik için uygulanabilir.
Introduction
Akut lenfoblastik lösemi (ALL) çocuklarda 1,2 en sık görülen hastalıktır. Pediatrik B-soy ALL (B-ALL) için genel sağkalım oranı yaklaşık% 85 olduğunu, ancak T-soy ALL (T-ALL) dahil olmak üzere belirli biyolojik alt tipleri, hatta güncel tedavi protokolleri ile hala kötü prognoz var. Nükseden ALL ileri tedavi bir meydan okuma 3 kalır. Akut lösemili erişkin hastaların çoğunluğu yukarı ön kemoterapi ile remisyon elde olmasına rağmen, birçok hasta hala nüks 4 muzdarip. Akut lösemi tedavisinde de mevcut kemoterapötik rejimler toksisite ile ilişkili kısa ve uzun süreli yan etkilere neden olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, özel olarak da normal dokular üzerinde minimal etkisi ile kanser hücrelerini hedefleyen, daha az toksik tedaviler büyük ihtiyaç vardır. Son yıllarda, vurgu roman, kanser hücreleri için spesifikliği olan moleküler olarak hedeflenen ajanlar, sıklıkla tekrarlı kimya kullanılarak geliştirilmesi üzerinde yerleştirilmiştirdaha sonra karşılaştırıldı ve 5, öncelikli edilmesi gereken birden çok aktif bileşikler üretir. Bu makale ilaç gelişimini kolaylaştırmak amacıyla, tek bir bileşiğin değerlendirilmesi için ya da birden fazla bileşiklerinin doğrudan karşılaştırmak için kullanılabilir akut lösemi tedavisi için TKIs klinik öncesi değerlendirilmesi için etkin bir strateji tarif etmektedir.
Burada sunulan yöntem dört adımdan oluşur. İlk olarak, biyokimyasal (1) ve anti-lösemi (2), bileşik (ler) in aktiviteleri hücre kültürü içinde değerlendirilir, daha sonra hedef inhibisyonu hayvan modellerinde, (3) olarak doğrulanmıştır ve TKİ (lar) ın son olarak tedavi edici etkisi olduğu Ortotopik lösemi ksenograft modellerinde belirlenir (4). Bu çalışmalar için, en yaygın biyolojik alt tiplerinin temsilcileri uygun hücre hatları, seçmek önemlidir. Hücre çizgileri biyolojik etkiler med olup olmadığını araştırmak için, her ikisi de, ilgi konusu hedef ifade ilgilenilen hedef eksikliği olan seçilmelidirhedef inhibisyonu ile iated. Bu anti-tümör aktivitesi için önemli olabilir hedef dışı etkiler küçük molekül inhibitörleri, geliştirilmesi için özellikle uygundur. Bu tür proliferasyonu veya hayatta kalma gibi işlevsel etkileri için hedefe bağlı olan bir hücre hattını seçmek için de gereklidir. Hedefi inhibe RNA girişimi ya da diğer özel araçlar kullanılarak (bu madde kapsamı dışında) ön hedef geçerlilik çalışmaları, hedef bağımlı hücre çizgilerini belirlemek için kullanılabilir. Bu hücre kültürü sonuçlar daha doğrudan in vivo deneyler için tercüme olabilir, öyle ki, murin ksenograftları oluşturabilir hücre çizgilerini seçmek için de arzu edilir.
Lösemi hücrelerinde TKIs tarafından aracılık edilen biyokimyasal etkinliğin değerlendirilmesi için, reseptör fosforilasyon bir azalma hedef inhibisyonunun bir göstergesi olarak kullanılabilir. Western blot analizi, veya ELISA tahlilleri antikorların mevcudiyetine ve özelliğine göre, kullanılabilecektir.Hedef için yeterli özgüllüğü olan antikorlar bulunmaktadır, bunlar daha nicel ve verimli olarak, ELISA deneyleri, tercih edilir. ELISA için yeterli özgüllüğü olan antikorlar mevcut değildir durumlarda, western blot analizi gerekli olabilir. Bu durumda, lizat büyük bir miktarda immüno-çökeltme düşük bolca hedeflerin saptanması için yararlı olabilir. Bu yaklaşım, çevresel uyarılara cevap olarak sinyal hızlı değişiklikler için izin vermek için çok kısa bir yarı ömre sahip olabilir, fosfo-proteinlerin, ölçümü için özellikle uygundur. Bazı fosforilatlanmış proteinler, son derece kararsız fosfatazlar ile kompleks oluşumunun bir sonucu olarak çok muhtemeldir. Bu fosforile edilmiş proteinler, sağlam ve sürekli saptanması için, aynı zamanda önceki bütün hücre lizatları hazırlanmasına fosfo-proteinin stabilize edilmesi için, pervanadate, geri dönüşü olmayan bir protein-tirosin fosfataz inhibitörü 6 hücreleri tedavi etmek de mümkün olabilir.
Karşıbiyokimyasal aktivitesi anti-tümör etkilere neden olup olmadığını belirlemek, hedefe bağlı biyolojik süreçlerin hücre bazlı deneylerde izlenebilir. Lösemi hücre hatları için, TKIs tarafından aracılık edilen anti-lösemi aktivitesi metilselüloz ya da yumuşak agar 7 gerçekleştirilen koloni oluşumu tahlilleri kullanılarak değerlendirilebilir. Bu TKİ ile tekrar tedavinin gerekli ise manipülasyon için daha uygun olan bir katı ortam olduğu gibi yumuşak agar tercih edilebilir. , Birçok akut myloid lösemi (AML) hücre çizgileri yumuşak agar içinde koloni oluşturacak birlikte, en önemlisi hücre hatları, sadece yan-katı ortam olduğu, metilselüloz koloniler oluşturacaktır. Bu metilselüloz kültürlerde orta ve / veya TKIs yenilemek için mümkün olmakla birlikte, sadece küçük miktarlar kullanılır ve sınırlı bir frekans ile olabilir. Benzer şekilde, metilselüloz bunları bozmadan koloniler leke daha zordur. Ön çalışmalar, metilselüloz ve / veya yumuşak agar ve t koloni oluşturmak için uygun hücre çizgilerinin yeteneğini tanımlamalıdıro kültür içindeki hücrelerin optimum yoğunluk koloniler örtüşmeyen ve yeterli sayıda (35 mm tabak başına genellikle 50-200 koloni) istatistiksel olarak ilgili veri elde etmek için bu tür.
In vitro deneyler, sağlam ve uygun maliyetli olan ve var ise bütün hayvan deneylerinde, terapötik bileşikler arasında ilerlemesi daha az etik sorunlar, hayvan modellerinde etkinlik ve güvenlik kanıtı gerektirir. İn vivo çalışmalar, insan akut lösemi hücre çizgileri orthotopically I tm1Wjl / SzJ (NTG) fareler ve TKIs kolaylıkla enjeksiyon ya da ağızdan sonda ile tatbik edilebilir l2rg NOD.Cg-Prkdc SCID transplante edilebilir. Bazı hücre hatları ksenogratflardır kurmak için sırayla radyasyonun düşük hücre hattı bağımlı doz NSG farelerin maruz gerektirebilir ve bu durumda fareler 5-10 günde iyileşme dönemi sonrası ışınlama olmaksızın ağızdan sonda tahammül edebilir. Bu el yazması kullanılarak B-ALL ve T-ALL xenogreftler nesil açıklarama örnekler ksenograftlarının gibi özel hücre çizgileri (697 ve Jurkat) hücre hatlarının geniş bir yelpazede kullanarak NTG farelerde kurulabilir. Diğer hücre çizgileri daha uygun olması durumunda ise, ışınlama için gereksinim, organ nakli ve hastalık başlangıcı ve ilerlemesini zamanlama hücrelerin optimum sayısı deneysel olarak tespit edilmelidir. İdeal olarak, bu modelleri (hastalığa bağlı ideal olarak 20-30 gün çalışma tedavi ve kaldırma başlangıcı arasında) tam bir penetrans (nakledilen her hayvan lösemi geliştirir), tutarlı kinetiği (lösemi bütün hayvanlarda benzer şekilde ilerler) ve uygun bir tedavi penceresi olacak . Nakledilen hücre sayısı penetrans ve kinetik tutarlılığını arttırmak için artan veya gerekirse tedavi penceresi geliştirmek için azaltılabilir.
TKIs in vivo hedef inhibisyonu aracılık olmadığını belirlemek için, numuneler TKİ veya yalnızca taşıyıcı ile tedavi sonrası lösemi ksenograftları olan farelerden toplanır. İdeal olarak, bir dozBu deneyler için uygulama d programı sık sık ticari laboratuarlar tarafından gerçekleştirilen ve bu makalenin kapsamı dışında olabilir farmakokinetik çalışmalar, tarafından yönlendirilir. Eğer farmakokinetik veriler, mevcut ise, TKİ tek bir dozundan sonra, hücre kültürü içinde etkili hedef inhibisyonu ve maksimum serum konsantrasyon için gerekli olan bileşik konsantrasyonu hayvan çalışmaları için bir başlangıç dozu tanımlamak için kullanılabilir. Farmakokinetik çalışmalar, aynı zamanda, farmakodinamik çalışmalarda ve tatbikat yolu için örnek toplama sonrası tedavi zamanlaması bilgilendirebilir. Hedef inhibisyonu etkilenen herhangi bir organda değerlendirilebilir fakat en kolay toplanır ve işlenir doku tercih edilir. Özel organlar etkilenir, ancak en akut lösemi hücre hatları, karaciğer, kemik iliği, dalak, periferal kan ve merkezi sinir sisteminde kurmak ve bu organlarda bütünleşme ölçüde modelleri arasında değişir. Burada sunulan protokol phosph değerlendiriyoro-protein western blot analizi kullanılarak kemik iliğinde önlenmesi, ama sağlam organ sürekli hasat için daha kolay ve örnek toplama ve işleme sırasında fosfo proteinlerin indirgenmesi için daha az olanak sağlayan, dondurulmadan önce az ya da hiç işlem gerektirebilir. İmmünohistokimya aynı zamanda, katı tümörler ya da lösemi etkilenen organların değerlendirmek için de kullanılabilir.
Son olarak, TKİ (ler) in terapötik etkinliği ortotopik lösemi ksenograft modellerinde belirlenir. Bu çalışmalar için, tedavi başladıktan zamanlaması hastalığın daha az ya da oluşturulacak şekilde, çeşitli olabilir. Tedavi başlangıç çalışmaları için naklinden hemen sonra başlayabilir ve daha sonra önemli bir hastalık yükü daha yakından tanı tedavi modeli yaklaştığı tespit edilinceye kadar sonraki çalışmalarda gecikecektir. İdeal olarak, bu hayvan modelleri de hastalık yükünün non-invaziv ölçümü için kapasitesine sahiptir. Biz ateşböceği lucifer tanıtımı için yöntemler optimizeHastalık başlangıcı ve kemik iliği ve solid organ hastalık yükünün ilerlemesi ve değerlendirilmesi non-invaziv, boyuna analiz için izin virüs benzeri partikülleri kullanarak lösemi hücre hatlarının içine ase gen. Bu yaklaşım için kritik poliklonal hücre çizgilerinin kullanımı ile ilgili lusiferaz sentezleyen lösemi gelişiminde değişkenliği önlemek için monoklonal lusiferaz etiketli hücre çizgilerinin kullanımı ve TKİ 8 ile muamele ilgisi yoktur.
Birlikte ele alındığında, bu adımlar tek bir TKİ değerlendirilmesi için veya birden fazla TKIs doğrudan karşılaştırılması ve sıralama için kullanılabilir. Burada yer alan protokolleri TKIs gelişimi üzerinde odaklanırken, bu yöntemler başka hedeflere göre uyarlanabilir ve deney geliştirme için düşünceler tarif edilmiştir. Böylece, bu strateji, akut lösemi tedavisi için daha geniş bir uygulama moleküler olarak hedeflenen ajanlar klinik öncesi değerlendirme olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makale, akut lösemi tedavisinde yeni tirozin kinaz inhibitörlerinin değerlendirilmesi için etkili bir strateji tarif etmektedir. Bu yaklaşımı kullanarak, biyokimyasal ve anti-lösemi etkinlikleri in vitro hücre bazlı deneylerde ilk olarak değerlendirilir ve daha sonra in vivo ksenograft modellerinde edilir. Bağışıklık beneklenme analizi başarılı TKIs ile tedavi sonrasında lösemi hücrelerinde hedef tirosin kinazın engellenmesini göstermek için doğrudan hücrelerde çok sayıd…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
In vivo görüntüleme Colorado Kanser Merkezi'nde Üniversitesi IVIS Paylaşılan kaynak (hibe P30-CA046934 tarafından desteklenen) kullanılarak gerçekleştirildi. Flow sitometri Sitometrisi paylaşılan kaynak, Colorado Kanser Merkezi'nde Üniversitesi (hibe P30CA046934 tarafından desteklenen) gerçekleştirildi. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (DKG için RO1CA137078) tarafından kısmen desteklenmiştir. ABLS Amerikan Pediatri Akademisi, Amerikan Pediatri Derneği, Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi (K12-HD000850) Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü hibe tarafından desteklenen Pediatrik Scientist Kalkınma Programı, bir üyesidir.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Hydrogen Peroxide | MP Biomedicals | #02194057 | GHS05, GHS07, H302-H318 |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | #S6508 | GHS07, H302+ H312+H332 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | #M7522 | GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 |
| ColonyGel Human Base Medium | ReachBio | #1101 | |
| 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma | #M5655 | GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | #214883 | |
| Nitrotetrazolium Blue Chloride | Sigma | #N6639 | GHS07, H302 |
| D-Luciferin Firefly, Potassium Salt | PerkinElmer | #122796 | |
| 4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride | Sigma | #D9542 | |
| FITC CD45 | BD Bioscience | #347463 | |
| FITC Mouse IgG1 Isotype control | BD Bioscience | #51-35404X-2 | |
| Gentamycin Sulfate | Sparhawk | #NDC58005-633-04 | |
| Protease Inhibitors | Roche | #11836153001 | |
| DNase | Sigma | #D4263 | |
| Protein G Beads | Invitrogen | #10-1242 | |
| Isofluran | VETONE | #NDC13985-030-60 | |
| Equipment | |||
| Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm | Nunclon | #D7804-500EA | |
| Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm | Nunclon | #D8429-1CS | |
| 6-well plates | BD Bioscience | #353046 | |
| 14 gauge x 4 inch blunt-end needles | Cadence science | #7956 | |
| 5 ml syringe with luer-lok | BD Bioscience | #309646 | |
| GelCount automated colony counter | Oxford Optronix | ||
| In vivo bioluminescence imaging system | PerkinElmer | #IVIS200 | |
| Scout pro portable balances, scale | Ohaus | #SP202 | |
| Broome style rodent restrainer | Plas-labs | #551-BSRR | |
| Ear punch, punch diameter: 2 mm | FST | #24210-02 | |
| Chlorhexidine swabs, Prevantics | PDI | #B10800 | |
| Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 | Monoject | #8881500042 | |
| Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile | Instech | #FTP-20-38 | |
| 1 mL Luer-Lok disposable syringe | BD Bioscience | #309628 | |
| Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle | BD Bioscience | #329465 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | #14084-08 | |
| Student fine scissors | FST | #91460-11 | |
| Moria ultra fine forceps | FST | #11370-40 | |
| Extra fine graefe forceps | FST | #11150-10 | |
| Scalpel handle | FST | #10003-12 | |
| Scalpel blades | FST | #10011-00 |
Riferimenti
- Jemal, A., Siegel, R., Xu, J. Cancer Statistics. 2010. CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).
- Kaatsch, P. Epidemiology of childhood cancer. Cancer Treat Rev. 36, 277-285 (2010).
- Pui, C., Mullighan, C., Evans, W., Relling, M. Pediatric acute lymphoblastic leukemia: where are we going and how do we get there?. Blood. 120, 1165-1174 (2012).
- Forman, S., Rowe, J. M. The myth of the second remission of acute leukemia in the adult. Blood. 121, 1077-1082 (2013).
- Ohanian, M., Cortes, J., Kantarjian, H., Jabbour, E. Tyrosine kinase inhibitors in acute and chronic leukemias. Expert Opin Pharmacother. 13, 927-938 (2012).
- Mikalsen, S., Kaalhus, O. Properties of pervanadate and permolybdate. Connexin43, phosphatase inhibition, and thiol reactivity as model systems. J. Biol. Chem. 273, 10036-10045 (1998).
- Zips, D., Thames, H., Baumann, M. New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation. In Vivo. 19, 1-7 (2005).
- Christoph, S., et al. Bioluminescence imaging of leukemia cell lines in vitro and in mouse xenografts: Effects of monoclonal and polyclonal cell populations on intensity and kinetics of photon emission. J. Hematol. Oncol. 6, 10 (2013).
- Endresen, L., Tveit, K., Rugstad, H., Pihl, A. Chemosensitivity measurements of human tumour cells by soft agar assays are influenced by the culture conditions. Br. J. Cancer. 51, 843-852 (1985).
- Tveit, K., Endresen, L., Rugstad, H., Fodstad, O., Pihl, A. Comparison of two soft-agar methods for assaying chemosensitivity of human tumours in vitro: malignant melanomas. Br. J. Cancer. 44, 539-544 (1981).
- Rudin, M., Weissleder, R. Molecular imaging in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 2, 123-131 (2003).
- Barrett, D., et al. Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling. Blood. 118, 112-117 (2011).
- Rice, B., Cable, M., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J. Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).
