Summary
Bu multiplekslenmiş mikroküre bazlı antikor dizileri kullanılarak, tükürük proteinlerini profil için bir prosedür tarif eder. Monoklonal antikorlar, kovalent karbodiimid kimyası kullanılarak floresan boya ile kodlanmış 4,5 um polimer mikro bağlanmıştı. Modifiye mikroküreler floresan sandviç immunoassay'ler kullanılarak tükürük protein seviyelerini ölçmek için fiber-optik mikro oyuk birikmiştir.
Abstract
Burada, aynı zamanda, bir fiber-optik mikroküre bazlı antikor dizisi kullanarak tükürük proteinlerini altı ölçmek için bir protokolü tarif eder. Kullanılan immüno-dizi teknolojisi, floresan mikroskobu kullanımı ile mikroküre bazlı süspansiyon dizi üretim avantajlarını bir araya getirmektedir. Video protokolde tarif edildiği gibi, ticari olarak temin edilebilen 4,5 um, polimer mikrosferleri, fiziksel olarak mikro kürelerin içine sıkışıp iki floresan boyaların konsantrasyonu ile ayırt yedi farklı türde kodlanmış edilmiştir. Yüzey karboksil grupları içeren kodlanmış mikro EDC / NHS birleştirme kimyası ile monoklonal antikorlar ile modifiye edilmiştir. Protein mikrodizi monte etmek için, kodlanmış ve işlevselleştirilmiş mikrosferlerinin farklı karıştırılır ve rasgele kimyasal olarak bir fiber optik demetin yakın ucunda dağlanmıştır 4,5 um olan mikro oyuk, yatırılır. Fiber optik demeti, bir taşıyıcı madde ve hem de m görüntülenmesinde kullanılmıştıricrospheres. Monte edildikten sonra, mikrodizi klinik toplanan tükürük yüzer proteinleri yakalamak için kullanıldı. İzleme, bir streptavidin-konjuge floresan prob, R-fikoeritrin farklı analitler için biyotinile edilmiş antikorların algılama oluşan bir karışımı kullanarak, bir sandviç bağışıklık dayanıyordu. Mikrodizi mikroküre kayıt ve değerlendirme sinyali için biri için üç farklı kanal, iki floresan mikroskop ile görüntülendi. Floresan Mikrograflarda sonra çözülür ve MATLAB bir ev yapımı bir algoritma kullanılarak analiz edildi.
Introduction
Mark Schena ve 1990'ların ortalarında arkadaşları tarafından bildirilen ilk mikroarray beri, bu güçlü araç, biyolojik araştırmaların 1. birçok alanda kullanılmıştır. Aynı zamanda, kan gibi teşhis sıvıları, birden fazla proteinleri saptayabilen antikor mikrodizileri, klinik teşhis ve biyolojik tarama 2-10 önemli uygulamaları vardır. Tükürük, kan gibi aynı analitlere birçok içeren, tükürük toplama, güvenli ve noninvaziv çünkü kan bir tercih alternatif olarak kabul edilmiştir, ve minimal-eğitimli tıbbi personel 11-13 tarafından yapılabilir. Şu anda, tükürük numuneleri kullanılarak çoğaltılmış çok katlı protein analiz hedef analitin 14 en düşük konsantrasyonu ve farklı biyolojik 15 arasında geniş bir konsantrasyon aralığı dahil olmak üzere, pek çok önemli faktör tarafından sınırlıdır.
.Burada, altı proteinlerinin analizi gösterilmektedir: insan vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), interferon gama-kaynaklı protein 10 (IP-10), interlökin-8 (IL-8), epidermal büyüme faktörü (EGF), matriks metalopeptidaz 9 (MMP-9), ve interlökin-1 beta (IL-1β) . Yöntemin performansı ilk olarak rekombinant proteinleri analit teşkil eden ve bloke edici tampon standart solüsyonları kullanılarak doğrulandı. Farklı kronik solunum yolu hastalıklarının hasta hem de sağlıklı kontrollerden toplanmış gerçek tükürük numuneleri, aynı zamanda tatmin edici bir performans ile test edilmiştir. Protokol diğer protein analit ve diğer mikroküre bazlı deneylere uygulanabilir olmalıdır. Bir ile karşılaştırıldığında, geniş bir dinamik aralık, en az spesifik olmayan etkileşimleri, daha az örnek tüketimi, ve düşük maliyet ile çeşitli proteinlerin düşük konsantrasyonlarda hızlı, doğru ve tekrarlanabilir bir eş zamanlı olarak analiz sağlar Bu platform, Analitik Kimya alan için önemli bir avantaj sunar benzer Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Şekil 1. . Tükürük profil için fiber optik mikrosfer antikor dizisi tatbik edilmesi için iş akışı (1) Mikro dahili olarak iki floresan boyalar ile kodlanır, (2) harici olarak şifrelenmiş mikro proteinine özel monoklonal antikorlar ile modifiye edilir, (3) birden fazla mesaj göndermiş mikro karıştırılır, (5) tükürük proteinleri sandviç bağışıklık tahlili ile mikro tarafından yakalanır, ve (6) floresan mikroskobu kullanılarak belirlenmiştir, ve (4) rasgele bir fiber optik demetin yakın ucunda kabartma mikro oyuk yatırılır.
1.. Mikroküreler Kodlama
- Bir amber cam şişe içinde sodyum öropyum (III) thenoyltrifluoroacetonate trihidrat (Eu-TTA, MW = 869,54 g / mol) tartılır ve tetrahidrofuran (THF) içinde bir 200 mM stok solüsyonu hazırlanır. Pipetleme tarafından yavaşça karıştırın; görsel doğrulamakboya tamamen çözülür.
- Bir amber cam şişe içinde kumarin 30 (C30, MW = 347,41 g / mol) tartılır ve THF içinde bir 12 mM stok solüsyonu hazırlanır. Pipetleme tarafından yavaşça karıştırın, görsel boya tamamen eriyene doğrulayın.
- Tablo 1'de listelenen nihai konsantrasyon elde etmek üzere stok çözelti ve THF kullanılarak her bir mikroküre tipi için çalışma çözeltisinin 700 ul hazırlayın.
- Mikro küreler (10% w / v) 'de vorteks yoluyla süspansiyon haline getirildi ve daha sonra bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne 60 ul süspansiyon transferi olduğundan emin olun.
- Kürecik süspansiyon 600 ul PBS ekleyin ve 20x pipetleme karıştırın. 3 dakika 10.000 rpm'de santrifüj tüpü ve dikkatlice supernatant çıkarın. Mikroküreler yıkamak için bu işlemi başka 2x tekrarlayın.
- THF aşama 1.5 edilene benzer bir prosedür kullanılarak topak ile mikrosfer 3 kez yıkayın.
- 3 dakika boyunca 10.000 rpm'de mikrosfer / THF süspansiyon santrifüj, süpernatant kaldırmak ve 600 ul pelet yeniden askıyaçalışma çözeltisi, Tablo 1 'de listelenmiştir. yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne karışımın aktarın.
- Parafilm ile mikrosantrifüj tüpü kapatın ve bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. 3000 rpm'de çalkalanır ve 24 saat boyunca inkübe, alüminyum folyo ile kaplı bir kutu kullanılarak setup kaplayarak ışıktan korur.
- Topak elde etmek için 3 dakika boyunca 10.000 rpm'de mikrosfer süspansiyon santrifüjleyin.
- Adım 1.5 'de tarif edildiği gibi yüzer boya çözeltisini çıkarın,% 0.01 Tween-20 ihtiva eden bir 6x 600 ul PBS ile daha sonra mikro 600 ul 6X metanol ile yıkayın.
- Kullanıma kadar ışıktan korumak 4 ° C'de% 0.01 Tween-20 ihtiva eden 600 ul PBS içinde kodlanmış mikro saklayın.
| Kürecik türü adı: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Eu-TTA (mM) | 100 | 100 | 10 | 100 | 10 | ||
| C30 (mM) | 1 | 1 | 6 | 6 | 1 | 6 |
Tablo 1. Eu-TTA ve C30 Konsantrasyonları çözümlerini çalışma.
2. Protein-yakalama Mikrokürelerin hazırlanması
- [- (N-morfolino) etansülfonik asit (MES) 0.1 M,% 0.9 NaCl,% 0.01 SDS, pH 5.7 2] ve PBS / SDS tampon maddesi (0.01 M sodyum fosfat, 0.154 M NaCl,% 0.01 SDS, pH MES tampon hazırlanması 7.4), oda sıcaklığında önceden.
- Güvenli-Lock 1.5 ml mikrosantrifüj tüpe (~ 2 mg küreleri içeren) 200 ul kodlanmış mikrosferdir süspansiyonu ekleyin. Bu, aşama 2.6 'de inkübasyon sırasında dökülmesini önlemek için bir mikrosantrifüj tüpüne bu tür kullanım için önemlidir. <li> aşama 1.5 'de tarif edildiği gibi 3 kez 600 ul tampon MES ile mikro yıkayın. Kürecik pelet 700 ul MES ekle ve pipetleme iyice karıştırın.
- Hazırlama 0.105 g / ml '1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidroklorür (EDC, MW = 191.7 g / mol) ve 0.163 g / ml sülfo-N-hidroksi-(sülfo-NHS, MW = 217,13 g / mol) ayrı tüplerde MES tamponu içinde çözeltiler.
- Taze kürecik süspansiyonu içine damla EDC çözüm damla hazırlanan 150 ul ekleyin. EDC böylece immobilizasyon verimliliği sağlamak için taze yapılmış çözümü kullanmak esastır, çok hızlı bir şekilde hidrolize. Hemen EDC ilave edilmesinden sonra, mikro 150 ul sülfo-NHS çözeltisi eklemek pipetleme ile iyice karıştırın ve süspansiyon, homojen bir kontrol edin.
- , Tüp Cap Parafilm ile mühür ve bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. , 4 saat boyunca 1500 rpm'de çalkalanır alüminyum folyo ile kaplı bir kutu kullanılarak ışıktan korur.
- Mikroküre esas asma santrifüjbir pelet formu ve süpernatant kaldırmak için 3 dakika boyunca 10.000 rpm'de iyon. Adım 1.5 'de tarif edildiği gibi 500 ul PBS / SDS tamponu 3x mikro yıkayın.
- , Topağa 200 ul PBS / SDS tampon ekleme de mikro karıştırın ve 60 ug yakalama antikorları ihtiva eden 300 ul PBS / SDS tampon çözeltisi aktarın. İlk olarak mikrosfer pelet askıya alma ve daha sonra antikor çözeltisi içine mikrosfer süspansiyon eklemek için önemlidir.
- , Bir çalkalayıcı üzerinde 4 saat süre ile 1500 rpm'de sallayarak antikor mikro-karışımı inkübe alüminyum folyo ile kaplı bir kutu kullanılarak ışıktan korur.
- Bir pelet formu ve süpernatant kaldırmak için 3 dakika boyunca 10.000 rpm'de mikrosfer süspansiyon santrifüjleyin. 500 ul StartingBlock (TBS) aşama 1.5 'de tarif edildiği gibi, 3 kez tampon engelleme ile mikro yıkayın.
- Bloke edici tampon TBS 1 ml mikro karıştırın ve bir kutu koy kullanılarak ışıktan korumak, bir çalkalayıcı üzerinde 1 saat süre ile 1500 rpm'de inkübe mikroAlüminyum folyo ile kırmızı.
- Bir pelet formu ve süpernatant kaldırmak için 3 dakika boyunca 7,000 rpm'de mikrosfer süspansiyon santrifüjleyin. Adım 1.5 'de tarif edildiği gibi 500 ul TBS, bloke edici tampon ile topak 3 kez yıkayın.
- Bir pelet formu ve süpernatant kaldırmak için 3 dakika boyunca 7,000 rpm'de mikrosfer çözeltisi santrifüjleyin. Bloklama tamponu 500 ul TBS ekle ve pipetleme karıştırın.
- Işıktan korumak, kullanılana kadar 4 ° C 'de modifiye mikrosfer süspansiyon saklayın.
- Gelen antikorları kullanarak mikroküreler diğer türlerini yapmak için bu işlemi tekrarlayın.
3. Fiber-optik Microarray Meclisi
- Yeni bir mikro santrifüj tüpüne otoklav içine protein-yakalama mikro her tip 50 ul karıştırın. Santrifüj stok mikroküreler 3 dakika boyunca 7,000 rpm'de havuzu, ve kalan hacim yaklaşık 100 ul böylece süpernatant kaldırmak.
- Elle kesme fiber optik uzunluk olarak yaklaşık 5 cm ve demetlerisıralı filmler alıştırma 30, 15, 9, 6, 3, 1, 0.5, ve 0.05 mikron boyutlu elmas kullanarak parlatma makinesi üzerinde iki ucunu lehçe. Her taneciği ayırmak için 2 dakika boyunca iyonu giderilmiş suda cilalı paket sonikasyon.
- Bir 0.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine bir küçük manyetik karıştırma çubuğu bir ifadeyle, protein içermeyen PBS içinde 400 ul tampon ve hava kabarcıklarını çıkarmak için 30 dakika için bir manyetik karıştırıcı plaka üzerinde karıştırın ekleyin.
- 150 saniye 10,16 için bir 0.025 N HCI çözeltisi içinde cilalı elyaf demetinin bir ucu Etch. Hemen daldırın ve 1 dakika boyunca iyonu giderilmiş suda kazınmış ucunu sonikasyon. Basınçlı hava ile, elyaf demetleri kurutun.
- Bir fiber tutucuya monte elyaf demetini ve 1 saat boyunca kabarcık içermeyen, protein içermeyen PBS tamponu içinde kazınmış ucunu bloke eder.
- Fiber optik demetin aşındırılmış ucunda saklı mikroküre süspansiyonu Deposit 1 ul alikosu. Alüminyum folyo ile bir kutu ile ışıktan korumak kurulum ve 15 dakika boyunca bekleyin. Süspansiyonun hacmi olacakbuharlaştırma yoluyla azaltmak ve kazınmış mikro oyuk içine mikroküreler zorlamak. Bu yükleme adımı bir kez daha tekrarlayın.
- Mikro oyuk içinde sıkışıp değil mikroküreler kaldırmak için numune çözeltisinin doymuş bir bez kullanın. Protein mikroarray artık kullanıma hazırdır. Tükürük analiz için 4.1 adıma hemen gidin.
4. Mikroküreler Mikroarray kullanarak Tükürük Numune Analizi
- 200 ul örnek çözeltisi (blokaj tamponu. Tükürük yüzer için toplama protokolü daha önce yayınlanmış olan 10 StartingBlock T20 (PBS) eşit hacmi ile seyreltilmiş 100 ul süpernatan tükürük) eklenir. bir 0.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine otoklavlanmıştır. Çözelti içine elyaf yüklenen protein mikrodizisini Dip ve 2 saat boyunca 600 rpm'de çalkalayıcı üzerinde inkübe, alüminyum folyo ile kaplı bir kutu kullanılarak ışıktan korur.
- % 10 Tween-20 19.6 ml PBS, mi içine 200 ul% 10 BSA çözeltisi ve 200 ul eklenmesi ile 20 ml yıkama tamponu hazırlayınx iyi hafifçe sallayarak.
- 200 ul yıkama tamponu ihtiva eden yeni bir mikrosantrifüj tüpü içine otoklav protein mikrodizisini Dip ve 2 dakika boyunca 600 rpm'de çalkalanır. Bu yıkama 3x tekrarlayın.
- Anti-VEGF, IP-10, IL-8, EGF, MMP-9 ve 5 ug / ml ihtiva eden bir saptama antikor kokteylinin 100 ul çözelti içinde inkübe mikrodizi, StartingBlock T20 IL-1β biyotinile algılama antikoru (PBS) blokaj tamponunda 600 rpm karıştırma cihazı üzerinde, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca, alüminyum folyo ile kaplı bir kutu kullanılarak ışıktan korur.
- Adım 4.3 'de tarif edildiği gibi yıkama tamponu ile 3 kez mikrodizi yıkayın.
- , 10 dakika boyunca bir karıştırıcı üzerinde 600 rpm'de, PBS içinde 20 ug / ml streptavidin R-fikoeritrin bağı (SAPE) çözeltisi 200 ul mikrodizisini inkübe alüminyum folyo ile kaplı bir kutu kullanılarak ışıktan korur.
- Adım 4.3 'de tarif edildiği gibi yıkama tamponu ile mikrodizi 5x yıkayın.
- Lifin uzakta (yani, uç distal ucunu temizlemekküreciklerden) mutlak etanol ile doymuş bir bez ile paket.
- Basınçlı hava ile, elyafın her iki ucunu kurutun. Fiberin uzak ucundan bir epifluorescent mikroskobu ve görüntü üzerindeki lif monte edin.
- Eu-TTA, C30 ve SAPE floresan emisyon yoğunluklarına karşılık mikrosferdir görüntü kazanır. Eu-TTA, C30 ve SAPE floresan görüntüleme için optik filtreler setup ve maruz bırakma süreleri, Tablo 2'de gösterilmiştir.
| Kanal | Eu-TTA | C30 | SAPE |
| Uyarıcı | 365/10x | 350/50x | 546/10x |
| Zayiflatıcı | 525DCLP | 400DCLP | 560LP |
| Emitör | 620/60m | 460/50m | 580/30m |
| Pozlama süresi | 1 sn | 0.3 sn | 1 sn |
Tablo 2. Mikrodizisinin üç floresan görüntü için parametreler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fiber optik demeti küçük bir bölümünü gösteren üç kanallardan Floresan görüntüleri, Şekil 2A-C'de gösterilmiştir. (Tartışma bölümünde daha ayrıntılı olarak tarif edildiği gibi) Bu görüntüler, MATLAB yazılmış bir algoritma kullanılarak analiz edilmiştir. Bu analiz, mikro kodunu çözmek için Eu-TTA kodlayan bir görüntü (Şekil 2A) için bilgiler ve C30 kodlama görüntüyü (Şekil 2B) hem çalışmaktadır, ve bir görüntü sinyalinin (Şekil 2C), farklı mikro-floresan yoğunluğu hesaplandı. Ilişkili protein standartlarının elde edilen kalibrasyon eğrileri ile, tükürük örnekleri proteinlerinin konsantrasyonları hesaplandı.
Şekil 2. (A) Eu-TTA kodlama görüntü, (B) C30 kodlama görüntü, (C) SAPE sinyali görüntü, (D) kod çözme sonucumikro farklı farklı renk ve şekillerde ile etiketlenmiş, s sinyal görüntüde üst üste.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Araştırmacılar, aşağıdaki adımlara fazla dikkat etmesi gerekir: daha iyi çözme doğruluğu, bu mikro-homojen tüm kuluçkalama içerisinde süspanse edildi doğrulamak ve mikro kodlama işlemi sırasında yıkama aşamaları için gereklidir. Buna ek olarak, kodlanmış mikrosferler, tüm deney boyunca ışıktan korunması gerekir. Uygun kodlama ve depolama prosedürleri takiben, biz genel olarak çözme doğruluk% 99 üstünde olduğunu öğrendim. Kodlanmış mikro-C donma önlemek ve ışıktan korumak 4 ° C'de depolanmalıdır. Uygun depolama koşullarında, kodlanmış mikro fazla altı ay boyunca stabildir. Son derece dikkatli mikro kaybını azaltmak için kodlama ve değiştirme aşamaları esnasında gereklidir. Yüzer maddelerin alınmasından Örneğin, mikro küre pelet rahatsız yoktur. Buna ek olarak, tamponlar içinde Tween-20 ve SDS de dahil olmak üzere daha iyi bir mikro-küre topaklama için gereklidir.
Bazıları of ortak sorun prosedürler vardır: (1) (yalnızca taze hazırlanmış EDC çözeltisi kullanımı ve EDC çözeltisi damla damla ilave edilmelidir, (2) otoklav borular kullanılmalıdır ve mikro küre çözeltisi, her enkübasyon aşamasından önce, yeni bir tüpe transfer edilmelidir 3) her bir yıkama aşaması sırasında, yüzer madde mümkün olduğu kadar ortadan kaldırmak için deneyin (4) değiştirilmiş mikro 4 ° C de muhafaza edilmelidir, donmayı önlemek ve ışıktan korur. uygun depolama koşullarında, modifiye edilmiş mikro küreler için saklanabilir hiçbir saptanabilir sinyal kaybı ile en fazla 3 ay.
Floresans görüntüleri analiz etmek için kullanılan algoritma MATLAB aşağıda kısaca tarif edilmektedir. İlgili kod tamamlayıcı malzemeler bulunabilir. Eu-TTA görüntü için bir kullanıcı-tanımlı yoğunluk aralığında piksel ilk süzülür. Farklı alanlarda, bir boyut-filtre ile kontrol edildi ışık zayıflatma neden olduğu "içi boş" merkez içeren alanları uzaklaştırılmış ve havadamikroküreler mevcut ileride işlenmek için bir izleme listesi halinde dizildi. İzleme listesindeki tüm mikroküreler daha uygun C30 görüntüde yanıtları ile süzüldü. Belirli bir mikroküre tüm pikseller için sinyaller ortalaması alındı. Ilgi bu mikro-sinyal gücü izlemek listedeki tüm mikro-yoğunluklarına ortalaması alınarak hesaplandı. Sonuçlar, istatistiksel olarak daha iyi temsil hale getirmek için, her bir tip mikro-25 minimum gerekli oldu. Spesifik olmayan sinyal en aza indirmek ve değişik deneyler arasındaki değişimini azaltmak için, her mikrosfer türleri için sinyalleri kontrol mikro gelen sinyali çıkartılmasıyla normalize edilmiştir.
Mikrosferlerin sinyal yanıt konsantrasyonları geniş aralıklarda proteinlerin birden fazla mesaj göndermiş tespiti için idealdir mikro yüzeyi üzerinde hareketsiz kılınmış antikor miktarı, ayarlanabilir. Bu mikrosferler, t farklı çaplara göreo mikrosferlerin bir tek tabaka oluşturmak için gerekli olan antikor miktarı, üretici 17 denklem ile tahmin edilebilir. 4.5 um bir çapa, antikorun 3 ug ile mikro-küreciklerin için 1 mg için gereklidir. Bu antikor, 60 ug (10x) 3 ug (0.5X) aşama 2.8 'de birleştirme çözeltisi içinde farklı antikor miktarlarda test ettik. Daha fazla antikor çözeltide kullanıldığında artış işaretleri gözlenmiştir. Farklı antikor ve uygulamaları için optimal antikor miktarları deneysel olarak tespit edilmelidir. "Kontrol mikro-küreler" doğrudan bir ELISA içinde negatif kontrol olarak imalatçı tarafından sağlanan ve 40'a kadar, rekombinan insan proteinleri 18 ile çapraz reaktivite göstermiştir fare izotipi IgG antikor ile birleştirilmiştir. Birleştirme yönteminin tekrarlanabilirliği değerlendirmek için, MMP-9, iki mikro toplu farklı günlerde birleştirilmiştir. Mikrosferlerin performans multiplexe kullanılarak test edilmiştir10 ng / ml MMP-9 d tespiti. Sonuçlar (detaylar sonuçları Tablo 3 'de gösterilmiştir) mikro kürelerden farklı gruplar arasında önemli bir fark görülmemiştir.
| Hayır | Tarih | Test 1 | Test 2 | Test 3 | Ortalama | Std |
| 1 | 01.12.2011 | 773,8 | 690,1 | 756.8 | 740,2 | 44.2 |
| 2 | 01/26/2011 | 791.9 | 721.8 | 867,0 | 793,6 | 72.6 |
Tablo 3. Bağlama yöntemleri (keyfi birim gösterilen sonuçlar) tekrarlanabilirliği.
Burada sunulan multiplexed yöntem, hızlı, doğru ve tekrarlanabilir sağlargeniş bir konsantrasyon aralığında (Tablo 4'te listelenmiştir results) üzerinde farklı proteinlerin analizi. Bu çalışmada kullanılan altı antikor çiftleri için potansiyel çapraz-reaktiflik de test edilmiştir. Çapraz reaktivite Tüm sinyaller (en az% 3) önemsiz olduğu bulunmuştur. Bu yöntemin diğer avantaj, bilinen Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ile karşılaştırıldığında, geniş bir dinamik aralık, en az spesifik olmayan etkileşimleri, daha az örnek tüketimi ve düşük maliyet 10 içerir. Tükürük örneğinin gerekli hacmi 100 ul kadar düşüktür ve deney, 3.5 saat içinde tamamlanabilir. Diğer süspansiyon dizileri ile karşılaştırıldığında, bu yaklaşımın bir sınırlama mikrodizi toplandı bir kez, bulgulama, en az 15 dakika içinde başlamış olması gerekiyor. Burada tarif edilen yöntem, iltihaplı hastalıklar ve kontrol (yayınlanmamış veriler) olan hastalardan toplanan insan tükürük örnekleri analiz etmek için laboratuarımızda kullanılmıştır. Bu yöntem uygulanabilir olmalıdırdiğer kompleks sıvı numunelerinin protein analizi için. Benzer bir mikroküre bazlı protein dizisi gibi mikroakışkan cihazları gibi diğer platformlarda kullanılabilir. Kodlama ve hareketsiz yöntemleri de diğer malzemelerden yapılan mikro küreler ile 9 da uygulanabilir.
| VEGF | IP-10 | IL-8 | EGF | MMP-9 | IL-1β | |
| Test 1 | 5365,9 | 2578,4 | 6508,7 | 2584,0 | 515.5 | 1147,4 |
| Test 2 | 5787,8 | 2577,9 | 7238,9 | 2919,2 | 375.7 | 1099,2 |
| Test 3 | 4944,6 | 2883,3 | 6726,3 | 3619,3 | 406,8 | 1084,1 |
| Ortalama | 5366,1 | 2679.9 | 6824,6 | 3040,8 | 432.7 | 1110,2 |
| Std. Dev | 421,6 | 176.2 | 374.9 | 528,3 | 73.4 | 33.1 |
Tablo 4. (Keyfi birim gösterilen sonuçlar), aynı numune üzerinde tükürük üç bağımsız testler için sonuçlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (hibe 08UDE017788-05) tarafından desteklenmiştir. EBP ayrıca Bilim ve Teknoloji İspanyol Vakfı (FECYT) destek kabul eder. Yazarlar yazının eleştirel okuma için Shonda T. Gaylord ve Pratyusha Mogalisetti teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eu-TTA dye | Fisher Scientific | AC42319-0010 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865-100ML | |
| Amber glass vial | Fisher Scientific | 03-339-23B | |
| Coumarin 30 dye | Sigma-Aldrich | 546127-100MG | |
| Microspheres | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| PBS 10x concentrate | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-100ML | |
| Tw-20 | Sigma-Aldrich | P7949-100 ml | |
| BupH MES buffered saline | Thermo Scientific | 28390 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 05030-500ML-F | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS256-500 | |
| Safe-lock microcentrifuge tube | VWR labshop | 53511-997 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | |
| Human VEGF capture antibody | R&D Systems | MAB293 | |
| Human IP-10 capture antibody | R&D Systems | MAB266 | |
| Human IL-8 capture antibody | R&D Systems | MAB208 | |
| Human EGF capture antibody | R&D Systems | MAB636 | |
| Human MMP-9 capture antibody | R&D Systems | MAB936 | |
| Human IL-1β capture antibody | R&D Systems | MAB601 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | R&D Systems | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) buffer | Thermo Scientific | 37542 | |
| HCl standard solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Protein-free (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37572 | |
| Recombinant human VEGF 165 | R&D Systems | 293-VE | |
| Recombinant human IP-10 | R&D Systems | 266-IP | |
| Recombinant human IL-8 | R&D Systems | 208-IL | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| Recombinant human MMP-9 | R&D Systems | 911-MP | |
| Recombinant human IL-1β | R&D Systems | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37539 | |
| Blocker BSA in PBS | Thermo Scientific | 37525 | |
| Biotinylated VEGF detection antibody | R&D Systems | BAF293 | |
| Biotinylated IP-10 detection antibody | R&D Systems | BAF266 | |
| Biotinylated IL-8 detection antibody | R&D Systems | BAF208 | |
| Biotinylated EGF detection antibody | R&D Systems | BAF236 | |
| Biotinylated MMP-9 detection antibody | R&D Systems | BAF911 | |
| Biotinylated IL-1β detection antibody | R&D Systems | BAF201 | |
| Streptavidin, R-phycoerythrin | Invitrogen | S-21388 | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma-Aldrich | E7023-500ML |
References
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Schena, M. Protein Microarray. , Jones and Bartlett Publishers. (2004).
- Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays. J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).
- Wang, C. C., et al. Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines. J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).
- de Jager, W., Velthuis, te, Prakken, H., Kuis, B. J., W,, Rijkers, G. T. Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
- Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers. Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).
- Vignali, D. A. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).
- Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
- Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis. Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).
- Blicharz, T. M., et al. Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva. Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).
- Mukhopadhyay, R.
- Wong, D. T. Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics. J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).
- Segal, A., Wong, D. T. Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better. Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).
- St John, M. A. R., et al. Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).
- Pantano, P., Walt, D. R.
- Schena, M. Protein Microarrays. , Jones and Bartlett Publishers. (2005).
- Mouse IgG1 Isotype Control [Internet]. , Available from: http://www.rndsystems.com/Products/MAB002 (2013).
