Summary
Ditranol (DT; 1,8-di-hidroxi-9 ,10-dihydroanthracen-9-ona) foi previamente relatada como uma matriz de DLAMI para a imagiologia de tecido de pequenas moléculas; protocolos para a utilização de DT para a imagiologia de MALDI de lípidos endógenos na superfície de cortes de tecido por positivo-ion MALDI-MS em um ultra-alta resolução quadrupolo-FTICR instrumento são fornecidos aqui.
Abstract
Imagiologia de espectrometria de massa (MSI) determina os padrões de localização e distribuição espacial dos compostos sobre a superfície de uma secção de tecido, utilizando principalmente MALDI (matriz assistida de laser de dessorção / ionização) baseada em técnicas analíticas. São necessárias novas matrizes para pequena molécula MSI, que podem melhorar a análise de baixo peso molecular (MW) compostos. Essas matrizes deve fornecer sinais de analitos aumentou, enquanto a diminuir sinais de fundo MALDI. Além disso, o uso de instrumentos de ultra-alta resolução, tais como a transformada de Fourier de iões ciclotrão ressonância (FTICR) espectrómetros de massa, tem a capacidade de resolver os sinais de analito a partir de sinais de matriz, e este pode superar parcialmente muitos problemas associados com o fundo proveniente da MALDI matriz. A redução nas intensidades dos clusters matriz metaestáveis por FTICR MS também pode ajudar a superar algumas das interferências associadas com picos de matriz de outros instrumentos. De alta resoluçãoinstrumentos, como os espectrômetros de massa FTICR são vantajosas, pois podem produzir padrões de distribuição de muitos compostos simultaneamente enquanto continua a fornecer confiança em identificações químicas. Ditranol (DT; 1,8-di-hidroxi-9 ,10-dihydroanthracen-9-ona) foi previamente relatada como uma matriz de DLAMI para a imagiologia de tecidos. Neste trabalho, um protocolo para a utilização da DT por MALDI imagiologia de lípidos endógenos das superfícies de secções de tecido de mamífero, por positiva de iões de MALDI-MS, de um quadrupolo híbrido ultra-resolução tem sido fornecida instrumento FTICR.
Introduction
Imagiologia de espectrometria de massa (MSI) é uma técnica analítica para determinar os padrões de localização e distribuição espacial dos compostos sobre a superfície de uma secção de tecido de 1,2. Matrix assistida a laser dessorção / ionização (MALDI) MSI para a análise de peptídeos e proteínas tem sido usado por mais de uma década e tem havido grandes melhorias em métodos para a preparação da amostra, a sensibilidade de detecção, resolução espacial, reprodutibilidade e processamento de dados 3,4. Ao combinar informações das secções histologicamente coradas e experimentos MSI, patologistas são capazes de correlacionar as distribuições de compostos específicos, com características interessantes fisiopatologicamente 5.
Os padrões de distribuição de moléculas pequenas, incluindo drogas exógenas 6,7 e seus metabolitos 8-10 também foram interrogados por MALDI-MS imagiologia do tecido 11. Os lipídios são, talvez, o cla mais amplamente estudadoss de compostos com imagens MALDI, tanto em MS 12-17 e MS / MS 18 modos. O uso de MALDI MSI molécula pequena imagem tem sido limitado por vários factores: 1) matrizes MALDI são eles próprios moléculas pequenas (tipicamente de m / z <500), que geram os sinais iónicos abundantes. Estes sinais abundantes pode suprimir a ionização de analitos de pequenas moléculas e interferir com a sua detecção 19,20. Livre de solvente revestimento de matriz 21, matriz de sublimação 22, e matriz de pré-revestidas MALDI MS 23, entre outros, têm sido desenvolvidos para melhorar a MSI de pequenas moléculas.
Novas matrizes que podem melhorar a análise de compostos de baixa MW são de grande interesse na pequena molécula MSI. Estas matrizes devem proporcionar sinais de analitos aumentou com sinais de matriz diminuiu. No modo positivo de iões, 2,5-di-hidroxibenzóico Ácido (DHB) e-4-hidroxicinâmico α-ciano de ácido (CHCA) são os dois comumente utilizadas matrizes de MALDI MS para 24 MSI 22,25. 9-aminoacridina foi usado para MSI de analitos próticos no modo positivo de iões 26, e para os nucleótidos e fosfolípidos no modo de ião negativo 26-29. 2-Mercaptobenzotiazole tem sido encontrado para dar detecção MALDI eficiente de lipidos 30, e tem sido utilizado para a imagem do cérebro do rato gangliósidos 31. A resolução ultra-alta de Fourier íon ciclotron de ressonância (FTICR) espectrômetros de massa tanto pode aliviar este problema, resolvendo sinais de analitos a partir de sinais de matriz 32. Outra vantagem do uso de FTICR-MS é que as intensidades dos aglomerados de matriz são metastáveis reduçãoed 33, o que também reduz essas interferências 27.
O uso de ditranol (DT; 1,8-di-hidroxi-9 ,10-dihydroanthracen-9-ona) na forma de uma matriz de DLAMI para a imagiologia de tecidos tem sido previamente reportado 34. No presente trabalho, um protocolo detalhado é fornecida para a utilização de DT para o MSI de lípidos endógenos na superfície das secções de tecido da lente de bovino, no modo de iões positivos.
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Protocol
1. Seccionamento Tissue
- Flash-congelar as amostras de emissão, uma vez colhidas, utilizando nitrogênio líquido, enviá-los em gelo seco (se o transporte for necessário), e armazená-los a -80 ° C até o corte do tecido. (Se forem utilizadas amostras comerciais, assegurar que as amostras são preparadas deste modo.)
- Corte órgãos para um tamanho gerenciável para atender a meta de MALDI. Apare quaisquer partes não desejadas do órgão. Para este estudo descrito aqui, as lentes de bovino foram decapsulated utilizando um procedimento previamente descrito 35 antes de seccionamento de tecidos.
- Remover órgãos inteiros a partir do freezer -80 ° C e corrigi-los em uma fase de corte de tecidos criogênico. Para corrigir uma lente de vitelo, coloque uma ou duas gotas de água na fase de corte de tecidos de um criostato. Rapidamente coloque a lente na água antes de ela se solidifica. Alternativamente, a temperatura de corte óptima (OCT) compostos também podem ser usados para fixar um tecido para a fase de corte. Se forem utilizados compostos outubro, um minimal quantidade de outubro deve ser aplicada, e deverá ser tomado cuidado para assegurar que as secções de tecido de corte não será contaminada com compostos outubro que podem interferir com a detecção e ionização dos analitos 5,36,37.
- Permitir que a temperatura no interior do criostato para equilibrar a -18 ° C. Temperaturas mais baixas ou altas podem ser usadas para os tecidos moles ou duras, respectivamente. Em seguida, corte o tecido equatorialmente em 20 mM fatias grossas. Use 10-15 uM rodelas grossas para a maioria dos tecidos, no entanto, por causa da fragilidade do tecido da lente de bovino, foram utilizados 20 uM de espessura. Para tecido lente bovina, descarte as seções primeiros tecidos e só usar fatias que estão perto ou no plano equatorial.
- Se um tecido ocular é trabalhada, utilizar de 1,5 mL de ácido fórmico (98% em pureza, LC-MS grau) para prewet a superfície de um óxido de índio e estanho (ITO) revestido lâmina de vidro.
- Transferir cuidadosamente as secções de tecido para a superfície do ITO-cociado vidro lâmina de microscópio dentro do criostato. O corte de tecido rapidamente descongelar e vai se tornar firmemente afixada à superfície do slide. Geralmente, várias secções de tecido podem ser montados numa mesma lâmina revestida de ITO desta forma.
- Liofilização o slide por 15 minutos antes da aplicação da matriz MALDI.
- Para os testes de matriz, dissolver as matrizes individuais, em solventes apropriados. Identificar manualmente 1 ml de cada solução de matriz para a secção de tecido. Além disso, identificar um padrão de calibração de pequenas moléculas para o tecido para verificação da sensibilidade MALDI.
- Adicione três marcas de ensino para a lâmina de vidro ITO revestido por escrever sobre a superfície não condutora da lâmina de vidro ITO revestido com uma caneta corretiva-fluido. Pegue uma imagem óptica do slide tecido usando um scanner de mesa e guardá-lo em um formato adequado, como tiff ou jpg.
2. Matriz de Revestimento
2.1. Automated Matrix Revestimento
- ApAs soluções matriciais camadas, que contêm o acetonitrilo ou misto de acetonitrilo / água como solventes, automaticamente para as superfícies das secções de tecido, utilizando um Bruker ImagePrep ou um pulverizador semelhante matriz electrónica.
- Cobrir as bordas da superfície da frente da lâmina de vidro ITO revestido com fita de modo a que a matriz não se revestir os bordos da lâmina. Isto assegura que as marcas de ensino sobre a superfície oposta pode ser usado para o alinhamento do tecido deslizante. Não cobrir as extremidades da corrediça com a matriz à medida que são usadas como pontos de contacto para manter a condutividade eléctrica da corrediça ITO revestido.
- Revestir a lâmina de vidro, utilizando vinte ciclos de revestimento de matriz (2-sec pulverização, 30 seg de incubação, e 60 seg de tempo de secagem para cada ciclo).
2.2. Manual de matriz de revestimento
- Se os solventes orgânicos (por exemplo, clorofórmio e acetato de etilo), que são incompatíveis com os materiais da matriz pulverizador electrónico de fabricação são requivermelho, use um pulverizador airbrush pneumaticamente assistida para aplicar a matriz. Adicione a solução matriz preparada para o reservatório de solvente do injetor do airbrush e aplicar um fluxo suave de gás nitrogênio pressurizado para preparar o spray.
- Cobrir as bordas da superfície frontal das lâminas de vidro ITO revestido com fita de modo a que a matriz não se revestir os bordos da lâmina. Isto assegura que as marcas de ensino sobre a superfície oposta pode ser usado para o alinhamento do tecido deslizante. Não cobrir as extremidades da corrediça com a matriz à medida que são usadas como pontos de contacto para manter a condutividade eléctrica da corrediça ITO revestido.
- Depois de ter sido observado sprays estáveis e finos, spray manualmente a matriz para que ele reveste completamente a secção de tecido. Aplique a quantidade mínima de solução matriz necessário para mal molhar a superfície durante cada ciclo para evitar uma possível deslocalização analito. Em geral, utilizam aproximadamente 10 ciclos de pulverização para o revestimento de uma matriz de corte de tecido, o número de ciclos édepende do tipo de tecido e composição da matriz.
3. MALDI MS
- Prepara-se uma solução de calibração de massa através da diluição da solução de "ES ajuste Mix" padrão por um factor de 1:200 em 60:40 de isopropanol: água (contendo 0,1% de ácido fórmico na mistura final).
- Introduzir 2 mL / min da solução "ES Sintonia Mix" diluído na dual-mode ionização electrospray (ESI) / fonte de íons MALDI no espectrômetro de massa FTICR, do lado da ESI.
- Utilizar o aparelho FTICR no modo ESI positivo-ion, com detecção de banda larga e um tamanho de aquisição de dados de 1.024 kb / seg. Os parâmetros típicos são ESI tensão electropulverização capilar, 3900 V; pulverizar tensão escudo, 3600 V; gás nebulizador (N 2), fluxo, 2 L / min, gás seco (N 2) e a temperatura de fluxo, de 4 L / min e 200 ° C; skimmer uma tensão de 15 V, o tempo de vôo (TOF), 0,009 s; gás de colisão (Ar) de fluxo, 0,4 L / s; fonte de íons acumulação tempo, 0,1 seg;e célula de colisão de íons acumulação tempo, 0,2 seg. Ajustar os parâmetros de operação FTICR, a fim de maximizar a sensibilidade analítica sobre a faixa de massa de m / z de 200 a 1.400, enquanto que a manutenção da boa no domínio do tempo de indução livre de cárie sinais (FID). Normalmente, os parâmetros de operação ICR são tensão ajudante, 8 V; sidekick tensão de offset, 8 V; amplificação excitação de 10; excitação tempo de pulso, 0,01-,015 seg; frente tensão da placa armadilha, 1,5 V; armadilha de volta tensão de placa, 1,6 V e tensão de entrada do analisador, -4 V. Depois de um conjunto de parâmetros de operação FTICR tem sido determinada, obter o espectro de massa ESI e calibrar o instrumento, utilizando as massas dos compostos de referência padrão na solução de "ES ajuste mistura".
- Para afinar o instrumento para uma operação de MALDI, dissolver várias aliquotas de 1 ul de uma solução mista e terfenadina padrão reserpina na solução da matriz a uma concentração de 1 | iM de cada, e detectar estas soluções directamente sobre uma das tissue secções (ou seja, uma secção de tecido de teste) o qual foi montado sobre uma corrediça de ITO revestido. Colocar a lâmina ITO revestido numa placa de corrediça de tecido (ou seja, um alvo de MALDI especial) e carregar o adaptador do lado de MALDI na fonte de iões ESI / MALDI dupla. Otimizar os parâmetros de funcionamento MALDI apropriadas para a potência do laser e do número de disparos de laser para a acumulação de sinal MALDI para cada digitalização em massa, etc parâmetros de operação MALDI típicos são: disparos de laser, de 50, e uma MALDI tensão da placa de 300 V.
- Depois de tuning, calibrar e otimizar o instrumento para experimentos MALDI-MSI, alinhe a localização física de uma secção de tecido a ser trabalhada com a sua imagem óptico registrado no software de imagem. Use as três marcas "de correcção de líquido", que tinha sido previamente colocados no lado oposto da superfície de deslizamento de ITO revestido (passo 1.9), para este alinhamento, utilizando um método de triangulação de três pontos.
- Realize uma ESI simultânea e MALOperação DI de modo que cada espectro de massa contém os picos de massa de referência da solução "ES Sintonia Mix" para o pós-aquisição de calibração de massa interna. Isto irá resultar na massa medição mais precisa durante o MALDI MS. Para isso, em primeiro lugar atenuar o sinal ESI, diminuindo a tensão capilar até os sinais MALDI dominar os espectros, enquanto os sinais de calibração ESI são ainda suficientemente elevada para a calibração interna de massa.
- Em seguida, configure um método automatizado para rastering irradiação laser. Definir as regiões de tecido a ser trabalhada e definir o tamanho adequado passo varredura laser. Note-se que tamanhos de passo menor raster fornecer imagens de tecido com maior resolução, mas requerem um tempo significativamente mais longo massa espectral aquisição e mais espaço de armazenamento de dados. O número de pixels da imagem que é dependente do tamanho do passo de varredura a laser para configurar e a dimensão do tecido. Para uma lente de bovino típico que tem um tamanho de tecido de 1 cm2, de uma imagem de tecido é geralmente composto de ca.
4. Análise de Dados
- Calibrar os espectros de massa MALDI usando calibração interna para a comparação inicial e selecionar picos para MS / MS. De-isótopo e selecionar os picos monoisotópico conforme descrito anteriormente, usando um script VBA personalizada 38.
- Exportar o resultado listas de pico monoisotópico e introduzir os valores medidos m / z para o METLIN 39 e / ou bancos de dados de metaboloma HMDB 40 para correspondência em massa com as entradas de biblioteca. Considere o (M + H) +, (M + Na) + e (M + K) + iões durante as pesquisas de banco de dados, com um erro de massa permissível de ± 1 ppm.
- Gerar imagens de MALDI para todas as entidades de lípidos detectados através da secção de tecido inteiro usando imagsoftware e-análise, com uma largura de filtro de massa de 1 ppm no vértice do pico.
- Uma vez que as imagens tenham sido gerados para todos os valores de m / z que correspondem as entradas do banco de dados, gerar imagens para todos os outros picos, assim como para procurar padrões de distribuição exclusivas que podem ser investigados posteriormente.
5. A confirmação das identidades dos Lipídeos fotografada
- Confirmar as identidades dos lípidos elevada abundância, que têm iões fragmentados característicos que podem ser detectados utilizando o instrumento FTICR (por exemplo, 184,073 para fosfolípidos), por MALDI-MS/MS. Realizar MALDI-MS/MS usando induzida por colisão de dissociação (CID) directamente sobre o tecido.
- Para as espécies de lípidos que não podem ser directamente confirmados por MALDI-MS/MS, usar um sistema UPLC acoplado a um espectrómetro de massa Q-TOF 34.
- Dissecar manualmente alíquotas contendo ~ 10 mg de tecido a partir da área onde as espécies de interesse estava localizada. Coloque essas alíquotas de tecido em 2tubos de centrífuga ml.
- Homogeneizar cada alíquota tecido em 250 mL de água, usando um moinho misturador com duas bolas de metal em aço inoxidável 5 milímetros.
- Adicionar 1 ml de solução em clorofórmio-metanol (1:3, v / v), e os tubos de vórtice. Em seguida, centrifugar os tubos utilizando uma microcentrífuga a 12000 xg durante 10 min.
- Recolher os sobrenadantes e seque-as em um concentrador de velocidade rotativo a vácuo.
- Dissolve-se os resíduos em 100 mL de isopropanol: água 30:70. Injectar uma alíquota de 10 uL na coluna UPLC de separação utilizando uma eluição de gradiente.
- Use as condições cromatográficas para LC-MS/MS em linha lipídicas, que foram previamente publicados 34.
- Corrente de iões gerar extraída (XIC) cromatogramas usando os valores teóricos, m / z, com uma janela de ± 50 ppm em torno das massas teóricas.
- Se os compostos autênticos para esses lípidos estão disponíveis, coincidir com os tempos de retenção dos compostos autênticos com aqueles do correspondente XIC picos das amostras de tecido. Se os compostos são a mesma, os tempos de retenção e dos espectros de MS / MS deve corresponder.
- Se um composto autêntico não estiver disponível, utilize o padrão de fragmentação do lípido detectado para corresponder a um padrão do espectro MS / MS a partir de uma base de dados tal como metaboloma METLIN ou HMDB. Use de novo de interpretação do espectro de massa para determinar uma possível estrutura para o lípido.
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Representative Results
As amostras de tecido que são seccionadas e degelo montados em lâminas de vidro ITO revestidas devem estar intactos, sem rasgo visível. Para muitos tecidos, descongele tecido direto montagem em uma lâmina de vidro ITO revestido é aceitável. Para alguns tecidos específicos, tais como lentes de bovino, extensa rompimento do tecido, muitas vezes é observado quando degelo montagem directa é utilizado (Figura 1a). De pré-revestimento da placa de vidro ITO com etanol ou ácido fórmico (Figura 1b) ajuda a manter a integridade das secções de tecido, durante a montagem do tecido.
Tanto a escolha da matriz e a selecção do solvente são factores importantes que influenciam a qualidade dos espectros de MALDI. Quando um espectro de MALDI MS apropriado é adquirido a partir da secção de tecido, o espectro de massa é normalmente densa com sinais de lípidos no intervalo de detecção de massa (Figura 2a). Uma matriz e um solvente deve ser escolhido de modo a que eles têm polaridadesont-size: 14.399999618530273px; linha-altura:. 28px; "> semelhante para os analitos de interesse, porque o processo de MALDI requer uma solução de fase sólida da substância a analisar em que os cristais de matriz Geralmente as melhores intensidades de sinal de analito provêm da utilização de matrizes MALDI com solubilidades semelhantes para que os analitos desejados 41,42. Figura 2a mostra um exemplo de um espectro produzido com um solvente eficaz matriz (70% de ACN com 0,01% de TFA), e a Figura 2b mostra uma má escolha de matriz e solvente (70% de MeOH com 0,01% de TFA) para o ditranol.
Uma das vantagens de um duplo modo de ionização por electrospray (ESI) / fonte de iões de MALDI é que ela permite que a adição de sinais de calibração ESI enquanto simultaneamente adquirir espectros de MALDI, sem interferir com o processo de ablação. Estes sinais de calibração ESI permite a calibração da massa interna para fornecer uma precisão de massa de alta com o erro de massa <0,5 ppm 38. Como oESI sinal da solução padrão de "ajuste ES Mix" pode ser uma ordem de magnitude mais forte do que os sinais MALDI dos analitos a partir do tecido, os sinais de calibração ESI-derivados deve ser atenuado. Sinais de calibração devem ser visíveis e de intensidade suficiente para a calibração do espectro, mas não deverá dominar o espectro.
Uma vez que o conjunto de espectros de massa a partir de uma experiência de MALDI-MSI tenha sido adquirida, a imagem de cada um dos iões detectados podem ser gerados, representando cada pixel uma mancha de irradiação de laser a partir da superfície de uma secção de tecido. A combinação de todos os pixels individuais com diferentes intensidades de iões ao longo da secção de tecido a partir de um experimento MALDI MSI reflecte a ionização de analitos alvo dentro do tecido 1. Isto pode, por sua vez, fornecer informação sobre as concentrações relativas dos analitos nas diferentes partes da secção de tecido (Figura 3b). Cuidados devem ser tomados no processamento dodados desde há muitos fatores podem afetar o que se vê e como os dados são interpretados. Na maioria das experiências, os dados são normalizados para a corrente total de iões de (TIC) em cada espectro. Sem esta normalização, as áreas com melhor analito da matriz de co-cristalização (ou seja, os chamados "pontos quentes") pode causar sinais mais fortes para os analitos e isso iria distorcer os dados ao fornecer informação que pode não se correlacionam bem com as concentrações relativas reais os analitos (Figuras 3c-3d).
Preparação de tecidos também pode mudar radicalmente a imagem que é gerada. Se a amostra é "muito molhado" (ou seja, demasiado solvente foi aplicado), em seguida, os analitos deslocalizar sobre o tecido e a maior parte da informação espacial serão perdidos (figura 3f). O método de aquisição de dados também é importante na imagem final obtido. Como os experimentos MALDI em cortes de tecidos não tratados são inerentemente "suja & #34;, a sensibilidade do instrumento pode diminuir ao longo do tempo. Para experiências breves esta redução pode não ser evidente, no entanto, pode ser um problema para as experiências mais longos ou amostras sujas. Se os dados são adquiridos linearmente através da amostra, o que pode conduzir a um desvio da localização de regiões específicas da secção de tecido serão analisadas depois da sensibilidade do instrumento diminuiu. Portanto, é recomendável usar pontos aleatórios para todas as aquisições de dados. Embora este método leva mais tempo, ele ajuda a eliminar ou minimizar esse viés nos dados.
Tal como mostrado na nossa publicação anterior 34, quando comparado com CHCA e DHB, DT permitiu a detecção de espécies de lípidos adicionais, enquanto que os lipídeos detectado com CHCA e DAP ainda podia ser detectado.
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Figura 1. Montagem e corte de tecidos. Imagens ópticas comparativos de duas seções de tecido de bovinos lente bezerro (20 mm de espessura), sem prewetting ácido fórmico (a), e com prewetting ácido fórmico (b), montado sobre as lâminas de vidro ITO-revestidos.
Figura 2. . Espectros de Massa MALDI MS espectros adquiridos diretamente de uma secção de tecido: a) um ideal espectro densamente povoada massa com sinais de lipídios (70% ACN com 0,01% de TFA), b) um espectro de massa gerada a partir de uma secção de tecido revestido com uma má escolha de solvente (70% MeOH com 0,01% TFA). Clique aqui para ver maior figura .
Figura 3. Imagens MALDI MSI imagens representativas MALDI MSI: a) uma secção de lentes de bovino de tecido, b) uma imagem MSI da mesma secção de tecido, c) uma imagem que mostra um ião MSI fundo, d) um mapa de iões não normalizada da mesma e de iões). uma secção de tecido lente bovina, e f) um mapa mostrando um íon analito parcialmente deslocalizado, devido à overwetting.
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Discussion
As considerações mais importantes para o sucesso MALDI MSI são: 1) a preparação do tecido, 2) escolha matriz; 3) aplicação de matriz e 4) interpretação e análise de dados. Quando a amostra e a matriz são adequadamente preparados, a aquisição de dados do MS é automatizado. A análise de dados a partir deste tipo de experiência é bastante trabalhoso.
Preparação do tecido adequado é fundamental para experimentos MALDI MSI sucesso. A fonte de tecido e o tratamento pode ter um grande impacto na análise final. As amostras devem ser imediatamente rapidamente congelados em azoto líquido e armazenadas a -80 ° C, e eles não devem ser armazenados durante um período prolongado de tempo, como alguns metabolitos podem ser instável até à temperatura de -80 ° C.
Para muitos tecidos de mamíferos, 10-15 ^ M grossas fatias de tecido têm sido recomendados para MALDI MSI. Nesses experimentos, as lentes de vitelo foram cortadas equatorialmente em 20 mm de espessura do tecido spiolhos seguintes desencapsulamento lente utilizando um procedimento previamente descrito 35. As secções de tecido de bovino mais grossas lentes de vitelo foram utilizadas porque verificou-se difícil manter a integridade de uma secção de tecido lente tanto durante o corte do tecido e o tecido durante a montagem. A lente é um tecido esfericamente simétrica ao longo de seu plano equatorial, portanto, apenas as fatias que estavam perto, ou pelo, o plano equatorial foram coletadas.
Devido à dificuldade em manter a integridade do tecido durante o corte de tecidos e de montagem, prewetting utilizando um solvente tal como o etanol (para proteínas e péptidos 35) ou ácido fórmico (para lípidos) pode ser utilizado. Deve-se também notar que, para a proteína e peptídeo de imagem, as amostras são frequentemente lavados com um solvente orgânico para remover as moléculas pequenas, incluindo lípidos e outubro utilizados para a montagem, no entanto, um passo de lavagem deve ser feito apenas com solventes que não se dissolvem no analitos de interesse, e deve ser evitado por smaanálise molécula ll.
A escolha da matriz também é crucial para todos os experimentos MALDI, no entanto, a performance da matriz no tecido pode não ser o mesmo que o desempenho da matriz com um padrão purificada. Por exemplo, a potência mínima de laser, DT gerados sinais relacionados com o fundo abundantes DT dos pontos de matriz isenta de tecido e estes sinais foram atribuídos como os oligómeros DT e os correspondentes aductos de sódio e de potássio, no entanto, sobre o tecido, muitos destes sinais foram não observada, indicando que o teste de diferentes matrizes no exemplo específico de escolha podem ser importantes na selecção da matriz adequada para uma determinada análise MALDI MSI. DT é raramente usado para a análise de lípidos devido ao elevado ruído de fundo gerado relatado pela matriz, no entanto, quando comparada com DHB CHCA e para a caracterização de-tecido de lípidos por MALDI-MS FTICR, DT produziu resultados favoráveis. Assim, esta matriz pode ser uma matriz, potencialmente úteis para imagiologia de tecidos MALDI utilizando este instrumento Co-cristalização Eficiente da matriz e do analito é um pré-requisito para a alta sensibilidade análise MALDI-MS. Assim, a solubilidade em fase sólida de um analito na matriz é importante no processo de MALDI 41,42. Matrizes MALDI com solubilidades semelhantes às dos analitos desejadas foram relatados para produzir as fortes intensidades de sinal de analito. Porque DT é um ácido orgânico fraco, assim como um composto orgânico muito hidrófobo, com base na teoria de Bronsted-Lowry de neutralização ácido-base clássico 43 e a teoria de solubilidade, espera-se a favorecer a ionização de carga positiva e menos polar compostos. Na verdade, verificou-se que os lípidos polares dominados os compostos detectados no modo de iões positivos quando DT foi utilizado como matriz. Os solventes utilizados para a preparação de uma solução matriz, também desempenham um papel importante na análise directa do tecido por MALDI-MS. O pH tem sido implicada como umfactor importante para a eficácia de uma matriz, e o TFA é um aditivo comum utilizada com CHCA e DHB. No entanto, com a DT, a adição de um modificador de ácido ou de base teve pouco efeito sobre os dados resultantes. Devido à hidrofobicidade da DT e sua limitada solubilidade em solventes polares, é recomendado um solvente orgânico lipofílico. Ao analisar os lípidos, uma mistura de clorofórmio-metanol (2:1, v: v) com ácido fórmico a 1%, que é um solvente orgânico típico para a extracção de lípidos, foi usado. Nós postulamos que esta proporciona uma melhor co-cristalização de lipídios com DT. A natureza lipofílica do solvente também pode evitar a solubilização de outros compostos, tais como proteínas e sais, tal como demonstrado na face de extracção anterior espectrometria de massa de análise de líquido (LESA-MS) 44 experiências. Isso levaria a uma melhor cristalização da matriz de lipídios e com menos contaminantes. O sistema solvente que é seleccionado para análise deve maximizar a solubilidade da matriz e a desianalitos vermelhos (lípidos), minimizando a solubilidade de contaminantes indesejados (sais e proteínas / peptídeos). O revestimento da matriz com a superfície do tecido deve ser tão uniforme quanto possível. Para maximizar a resolução espacial da imagem, o tamanho dos cristais deve ser tão pequena quanto possível 45. A utilização de um pulverizador de matriz electrónica, a matriz pode ser revestida de modo uniforme e reprodutível com um tamanho de cristal pequeno. Este é o método preferido no nosso laboratório. É muito preferida a aplicação manual, uma vez que reduz o tamanho do ponto, homogeneidade e reprodutibilidade. No entanto, muitos dos solventes que são úteis para a MSI de moléculas pequenas não são compatíveis com os materiais utilizados na fabricação do pulverizador matriz automatizado. Embora ainda não implementado em nosso laboratório, a aplicação da matriz sublimação base tem sido recomendada para a análise de lipídios 22. Este método proporciona uma melhor (isto é, reduzido) o tamanho do ponto, homogeneidade e reprodutibilidadebilidade e este deveria ser o método de eleição quando a matriz é seleccionada amável para este método. Para o revestimento de matrizes contendo solventes incompatíveis com o pulverizador matriz automatizado (incluindo clorofórmio), um método alternativo de revestimento de matriz é a utilização de uma pistola de escova de ar. Para estas soluções de matriz, foi utilizado um pulverizador airbrush pneumaticamente assistida. Embora o uso da pistola de ar, escova não é o método ideal, pode ser o único método que pode ser utilizado para solventes e matrizes que são incompatíveis com os outros métodos, e com a formação e experiência, pode gerar revestimento de matriz muito uniforme. Quando se aplica a solução de matriz manualmente, apenas a quantidade mínima de líquido deve ser aplicada durante cada ciclo de mal molhar a superfície do tecido. Muito líquido poderia deslocalizar analitos devido aos solventes orgânicos. Há problemas de reprodutibilidade com aplicação e experiência manual em revestimento do slide com este método ié essencial para o sucesso. Devido à natureza da aplicação manual de matriz arma escova de ar, deve ser tomado cuidado para assegurar que uma camada uniforme seja feita, um revestimento não homogéneo pode levar a dados distorcidos, que é representativa do revestimento de matriz e não sobre a localização do analito. Ao realizar experimentos MSI MALDI, a identificação inicial dos analitos detectados geralmente é baseado no banco de dados do metaboloma busca das massas precisas medidas que são geralmente disponível apenas quando um instrumento de alta resolução é utilizada 38. A fonte de iões ESI / MALDI dupla no espectrómetro de massa Apex-Qe-12 Tesla híbrido quadrupolo-FTICR permite a adição de sinais de ESI-gerados para uso como os picos de calibração de massa internos para cada um dos espectros de massa MALDI, sem afectar a dessorção de MALDI / processo de ionização. O uso de calibração de massa interna é crucial para a precisão da medição de massa de alta em MALDI-FTICR. Calibração externa não pode ter plenamente em conta oefeitos de carga espaço dentro da célula ICR 46-48. A afinação e calibração do FTICR é crucial para o sucesso. Por este tipo de instrumento um parâmetro chamado "tempo de voo" (TOF), o qual é o tempo que leva para que um ião de viajar a partir da célula de colisão para o analisador (célula ICR) é um dos mais importantes definidos pelo utilizador configurações que influenciam a sensibilidade de detecção de um instrumento FTICR. Dentro de um determinado intervalo de massa (isto é, m / z 200-1,400), um TOF baixa favorece a detecção dos iões inferiores m / z e um TOF favorece a detecção de iões mais elevados m / z. Assim, para a detecção de alta sensibilidade de ambos os iões de baixa e alta m / z dentro da gama de massa de detecção, um valor de 9 TOF ms é desejável. Para um experimento prático, um trade-off deve ser feita entre o tamanho razoável de aquisição de dados, resolução de massa, eo tempo gasto com a aquisição de dados de imagens de MS. Para uma experiência FTICR MS, o tamanho do ficheiro de dados adquiridos e a massa resolutiem são dependentes do tamanho de aquisição de dados do decaimento de indução livre sinal (FID). Um tamanho maior de aquisição de dados irá resultar em uma resolução maior massa e um tamanho de arquivo de dados maior. No entanto, um tamanho maior de aquisição de dados, também provoca uma velocidade de varrimento lenta MS. Como um trade-off, recomenda-se que um tamanho de aquisição de dados de 1.024 kb / seg ser utilizado na FTICR. Um menor tamanho de aquisição de dados e uma resolução menor massa correspondente não permitem a separação de algumas espécies de íon isobáricas. O raster tamanho do laser etapa também deve ser escolhido de modo que é pequeno o suficiente para proporcionar uma boa resolução de pixels para imagens de MS dos analitos de interesse, no entanto, um tamanho muito pequeno passo raster pode tornar os arquivos de dados incontrolável considerando um arquivo de dados MS imaging é composto por milhares de espectros de massa MALDI. Dada a dimensão relativamente grande de cristalinos de bovinos, ca. 1,2 -1,5 cm de diâmetro, é utilizado um tamanho do passo de varredura de 250 um. Usando um conjunto de dados acqu 1,024 kb / segtamanho isition e uma mM raster tamanho 250 etapa, nosso conjunto de dados da amostra foi de aproximadamente 60 GB. Durante a aquisição de dados, uma análise de mancha aleatória deverá ser utilizado, uma vez que evita a polarização com base em local, devido à atenuação do sinal gradual, no entanto, lugar aleatória requer significativamente mais tempo para a aquisição dos dados. Como os conjuntos de dados MALDI MSI adquiridos em nosso instrumento FTICR MS incluem dados precisos sobre massas, o m extraído / z podem ser pesquisados em bancos de dados metaboloma como METLIN e / ou HMDB. Usando uma janela de ± 1 ppm as atribuições iniciais de muitos sinais de íons para metabólitos são de alta confiança. No entanto, porque muitas espécies têm a mesma fórmula química, a confirmação da identidade deve muitas vezes ser feito usando meios alternativos. Assim, as experiências de MS / MS, e comparação do espectro MS / MS com os dados publicados anteriormente deve ser realizada para uma identificação confiante. Espectros MALDI-MS/MS às vezes pode ser adquirido diretamente no aparelho FTICR, mas para mamoléculas lipídicas ny, suas abundâncias e / ou a eficiência de ionização são insuficientes para a obtenção de dados MS / MS úteis, e de enriquecimento e de purificação antes de LC-MS/MS são necessários. Nestas análises, a maioria dos lipídios observados foram fosfolipídios polares, e foram designados como PCs, PES, SMS, PSs, PGs, PAs, e fosfatos de ceramida (CerPs); outras moléculas lipídicas identificados incluem lipídios esteróis, acilcarnitinas e glicerídeos. Com base nas propriedades do solvente e a matriz, isto é de se esperar. Os espectros MS / MS de PCs contêm um pico proeminente a m / z 184,073, que foi atribuído ao grupo polar da cabeça PC, fosfocolina, bem como informações estruturalmente importante adicional, que pode dar uma identificação inequívoca das moléculas. Além disso, utilizando este método, muitos lípidos esteróis são detectados, no entanto, a maior parte não pode ser atribuído inequivocamente a identidade única, mesmo com os dados MS / MS. Adutos fortes potássio geralmente predominam os espectros, mas protonada e sodiated adutos também pode ser detectada. Como o processo de MALDI MS só é capaz de fornecer informações de abundância relativa com base na eficiência de ionização local dentro de cada pixel, é preciso ter cuidado na interpretação dos dados MALDI MSI sem isótopo estável padrões internos rotulados 49. Além disso, para a confiança nos resultados de localização, a confirmação de todos os padrões de distribuição detectados deve ser feito através de métodos alternativos. Performing LC-MS/MS em amostras de tecidos dissecados para confirmação é recomendado. Com base nas massas precisas medidos nas fórmulas de baixa gama químicos em massa pode ser gerado por um dado m / z; dentro de um erro de massa 1 ppm e permitindo um número ilimitado de C, H, O e N, e um máximo de 2 S e 2 P muitas vezes apenas uma única composição elementar é possível. Esta m / z também pode ser pesquisado contra o HMDB e as bases de dados METLIN, o que pode dar origem a compostos candidatos potenciais. Infelizmente,no FTICR MS a baixa massa de corte é ca. 130 Da, o que pode torná-lo difícil de executar diretamente MS / MS. Assim, a confirmação utilizando outro sistema é muitas vezes necessário. Experimentos LC-MS/MS Q-TOF são geralmente realizados em amostras de tecido que foram dissecados manualmente em áreas específicas dos tecidos de interesse. Usando o método de extração de lipídios descrito, XICS podem ser gerados para os compostos-alvo e MS / MS pode ser adquirido para confirmação. Qualquer comparação com um padrão autêntico ou de novo elucidação estrutural é necessária antes que possa haver uma atribuição química confiante. Ditranol foi utilizado para estudar os padrões de distribuição de lípidos na lente de vitela e também testado em fígado de rato, coração, rim e tecidos 34. MALDI MSI pode ser utilizado para o diagnóstico de estados de doença humana, e já está a ser utilizada para a análise patológica 50. Com o desenvolvimento de mais robusta e rápida tecnologias para MALDI MSI, a localização espacial de compostos específicos pode ser uma informação útil para um patologista. Uma vez que um objecto de análise pode ser rotineiramente fotografada usando um método baseado no MSI MALDI, que pode ser utilizado para fins de diagnóstico. De facto, a imagem do tecido pode ser realizada em ambiente hospitalar, com um instrumento localizado próximo à sala de operações, onde, como já foi demonstrado 51, que poderia ser utilizada para determinar com precisão as margens de tumores.
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Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Genoma Canadá e Genoma British Columbia para financiamento plataforma e suporte. Agradecemos também a Dra. Carol E. Parker para revisão crítica da assistência manuscrito e edição. CHL também graças a Columbia Proteômica rede britânica de apoio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Liver | Pel-Freez Biologicals | 56023-2 | |
| Bovine Calf Lens | Pel-Freez Biologicals | 57114-2 | Sample should be decapsulated29 before use |
| Dithranol (DT) | Sigma-Aldrich | 10608 | MALDI Matrix |
| α-Cyano-4-hydroxy-cinnamic Acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | 70990 | MALDI Matrix |
| 2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB) | Sigma-Aldrich | 85707 | MALDI Matrix |
| Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | |
| Terfenadine | Sigma-Aldrich | T9652 | |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 14265 | |
| Ammonium Formate | Sigma-Aldrich | 14266 | |
| Ammonium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 320145 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 302031 | |
| Water | Sigma-Aldrich | 39253 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34967 | |
| Ethyl Acetate | Sigma-Aldrich | 34972 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 34965 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 366927 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 34850 | |
| Ethanol | Commercial Alcohols | 95% | |
| ES Tuning Mix | Agilent Technologies | G2431A | |
| ITO Coated Glass Slides | Hudson Surface Technology | PSI1207000 | Ensure that samples are placed on the electrically conductive side |
| Wite-Out Shake-N-Squeeze Correction Pen | Bic | WOSQP11 | |
| Airbrush Sprayer | Iwata | Eclipse HP-CS | |
| ImagePrep | Bruker | 249500-LS | |
| MALDI adapter | Bruker | 235380 |
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