哺乳類の外皮は、個々の種の特徴的な化学組成を提供することができ、溶媒抽出可能な脂質が含まれています。本稿では、薄層クロマトグラフィーを用いて外皮組織から単離さ広い脂質クラスを分離し、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析によりトリアシルグリセリドプロファイルを決定するためのルーチンの方法を提示する。
哺乳類の外皮は、皮膚表面に油状物質を分泌する皮脂腺が含まれています。皮脂産生は、病原性微生物に対する防御的で、自然免疫系の一部である。異常な皮脂生成および化学組成はまた、特定の皮膚疾患の臨床症状である。皮脂は種特異的であるトリアシルグリセリを含む脂質の複雑な混合物が含まれています。多様な脂質クラスが示す広範な化学的性質は、皮脂組成物の具体的な決定を妨げる。脂質の分析技術は、一般的に労働集約的であり、サンプル調製のコストを増加させ、化学誘導体化を必要とする。本稿では、薄層クロマトグラフィーにより哺乳動物外皮、別個の広い脂質クラスの脂質を抽出し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法を用いてトリアシルグリセリドコンテンツをプロファイルする方法について説明します。この強力な方法は、直接判定することができる種および個体間のトリアシルグリセリドプロファイルの、そしてそれは容易に哺乳類の任意の分類群にも適用することができる。
哺乳類の外皮組織は、表皮、ケラチン構造( 例えば 、髪と爪)、および外分泌腺があります。皮脂型の外分泌腺をまとめて毛嚢脂腺ユニット1と呼ばれる毛包に関連している。皮脂腺は、皮脂と呼ばれる皮膚表面に油性滲出液をリリース。皮脂はグリセロ脂質( 例えばトリアシルグリセリ[タグ])、遊離脂肪酸アシル(FFAは)、ステロール/ワックスエステル、およびスクアレンから概ね構成されています。皮脂の化学組成は種特異的である2。先天性免疫系の一部であると抗菌機能3を提供することに加えて、皮脂脂質は、皮膚4を介して蒸発水損失、細胞の完全性および遺伝子調節5、及び薬物吸収6を含む重要な生理的プロセスに影響を与える。皮脂の脂質組成物はまた、疾患マーカーとして役立つことができる。変更された比率と皮脂Bの量道路脂質クラスは、他の10の中で、尋常性ざ瘡7、フケ8、脂漏性皮膚炎8、皮脂欠乏9、などの疾患の臨床徴候である。表皮と髪の組織をステロールおよびその誘導体、タグ、FFAは、セラミド、リン脂質、およびその他のマイナーな脂質成分を含む変数のプロファイルが含まれています。外皮脂質は、疾患プロセスで機能することができるので、健康で病気にかかった個体間でTAGの化学組成の違いを決定することは、疾患の臨床診断に有用である可能性がある。
脂質は一般に非極性または非極性-極性置換基11のいずれかを有する水不溶性有機化合物であると定義される。脂質構造は、長い炭化水素鎖、(ワックスエステル、FFAは、アルコール、ケトン、およびアルデヒドを含む)、酸素化アルカン、又はコレステロールなど12などの複雑な環構造であってもよい。構造に基づいた脂質の8の主要なクラス(FFAは、glycerolipiがありますDS [GL]、グリセロリン脂質に応じて化学的特性の広い範囲を示す[GP]、スフィンゴ脂質[SP]、ステロール脂質[ST]、プレノール脂質[PR]、サッカロ[SL]、およびポリケチド[PK])、クラス13。による脂質クラスの化学的性質に大きなばらつきのために、脂質分子の事前の誘導体化なしに直接プロファイリングが望まれている。脂質研究におけるOne出射方法は、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF MS)14と組み合わせた薄層クロマトグラフィー(TLC)である。
MALDI-TOF MSは、タンパク質を同定し、トリプシンにより消化されたタンパク質15から発生した高精度なペプチドイオンの質量「フィンガープリント」を、特定のアミノ酸配列にそれらを関連付けるためにプロテオミクス研究において広く使用されている。 MALDI-TOF MSはまた、16〜18のTAGなどの脂質を含む他の生体分子のクラスをプロファイリングするために使用することができる。 MALDIは、標準マトリックスの使用を必要とする芳香族および共役二重結合構造を含む有機化合物をICALLY。マトリックス分子を穏やかに、検体にレーザーのエネルギーを伝達プロトン移動を促進し、単一荷電気相イオン19-21を産生するのに役立つ。イオンは、高真空下で高電圧場に付し、続いてイオンをその質量電荷比に比例する速度の差により分離されているTOF質量分析器に加速される。たとえ非常に大きな生体分子を簡略化スペクトル分析のための単一荷電分子イオン種を生成する、小さな断片化してイオン化することができる。事前の誘導体化せずに直接脂質分子を分析する能力はlipidomic研究18において、MALDI-TOF MSの準備が導入を推進してきました。
本論文では、毛髪から外皮脂質を分離し、分析するためのルーチンの方法を提示し、皮脂の分泌物や東欧の赤バットのplagiopatagium(Lasiurus borealiS)。これは、ホワイト鼻症候群(WNS)22の疾患プロセスを解明するためにバット外皮脂質中の種間変動を決定するために使用される。 WNSは、コウモリの真菌性疾患であり、Geomycesは 23〜25を destructans新たに記載し好冷種によって引き起こされている。 WNSは500万北米の洞窟のコウモリの死を引き起こし、農業26,27に損傷を数十億ドルの潜在的な経済的影響と、脆弱なコウモリの種の絶滅を脅かしています。 Gの手順を調査するために、感染destructans、脂質は東部赤いコウモリの髪と翼組織から抽出し、MALDI-TOF MSによるその後の分析のためのTAG画分を単離するためにTLCで幅広い脂質クラスに分離した。 TAGは、短いアシル鎖を含有し、容易に小さなマトリクス干渉MALDI-TOF MSによって検出される。
本論文では、脂質分子の時間のかかる誘導体化せずに、分取TLCで、哺乳動物の外皮から分離され、幅広い脂質クラスに分離し、MALDI-TOF MSによりタグプロフィールを決定するためのシンプルかつ堅牢な方法を提示します。 MALDI-TOF MSとTAGの品質スペクトルを製造する際の重要なステップは次のとおりです。最小限の汚染や酸化を有する化合物の1)が成功抽出、クロマトグラフィーによる2)十分な分離と分離、およびMALDI-TOFによって3)高分解能と質量精度をMS。
本論文では、タグのMSプロファイルを得るために、東部の赤バットのplagiopatagiumからの中性脂質画分を抽出して分離する方法を示しています。本研究は、(哺乳:翼手)コウモリの種を使用しながら、これらの方法では、任意の哺乳動物種の外皮脂質を研究するように拡張することができます。バット外皮はタグ、FFAは、squaより少ない量で、主にコレステロールであることを特徴とするナフタレン、およびステロール/ワックスエステル。 ( -ヒトでの7%が、26 – 1打席中62%)コレステロールは、より大きな割合で発生している間コウモリにおける皮脂脂質比は、そのスクアレンでヒトと異なることは、(ヒトでは最大16%とは対照的に)低量で存在している22 、31。比最大28%が東部赤いコウモリの髪で発見されている間、人間の毛は、約3%のタグが含まれている。コウモリからの脂質のサンプルの抽出は、他の種についても同様である。この研究において溶媒に浸した綿ボール皮脂を除去するために使用されるが、一方はまた、複数回の外皮表面上に溶剤を含有する試料バイアルまたはチューブを反転させることができる。特殊なテープ製品は、表面32脂質を抽出するための代替手段を提供する。適切な脂質抽出の重要な部分は、皮膚の油から汚染を最小にすることである。これは、簡単にすべてのサンプルと検査用手袋を身に着けている間にティッシュで食器を拭く、メタノールでスクイーズボトルを維持し、すべてのガラス器具や調理器具を噴霧することによって達成される。酸化Ofはポリ不飽和アシルBHTの添加によって抑制され、それは温度によらずにサンプルが格納されているのに使用されるべきである。
生体分子分析は、通常、汚染物から目的の分子を分離するためのクロマトグラフィー工程を必要とする。 TLCは、気体又は液体クロマトグラフィー用計装の必要を回避し、堅牢で再現性のある結果を達成するために、より少ない技術的な経験を必要とし、この方法で使用される。関心対象の脂質クラスに依存して、多くの異なる移動相を組み込むことができる。さらに、HPTLCプレートおよび走査デンシトメトリーを使用すると、定量的な結果を達成するために使用することができる。 TLC法のバリエーションがここにリストするには余りにも多数であるが、脂質のTLCで使用されるいくつかの一般的な移動相はクロロホルムのものがあります。非極性脂質28の分離のためのエチルエーテル:メタノール:リン脂質や糖脂質やイソオクタンを分離するための水を。他の脂質クラスからタグを分離するという点で、H、E:そうlventシステムは一貫して動作し、同等の結果を提供します。
TLCを使用する別の利点は、関心対象のバンドが急速に検体の前に誘導体化することなく、MALDI-TOF MSを用いてプロファイリングすることができることである。この研究では、シリカTLCプレートから除去し、分析物は溶離溶媒の吸着剤および蒸発を分離するための遠心分離およびその後の溶媒中での超音波処理によって、そこから溶出する。あるいは、マトリックスは、検体バンドTLCプレート上で分離し、次いで、直接MALDI-TOF MSにより分析33上に直接適用することができる。 MALDI-TOF MSによる成功プロファイリングは、十分なサンプル調製およびチューニングや測定器の校正を実行した作業者の熟練度に依存していません。器具は、目的の分子のための適切な分子量範囲をカバーする標準で毎日較正されるべきである。機器の適切な感度と分解能( 例えば ≥万)もconfirmeする必要がありますACTHを毎日Dは
哺乳動物の外皮の表面上に見られる皮脂脂質成分は、真菌/細菌性病原体によるコロニー形成において役割を果たし得る。したがって種と個体間の化学組成についての知識は、人間と野生動物の疾病の過程についての手がかりを提供することがあります。病気にかかったと健常者の間で種内の差異は、疾患の検出および診断の補助という臨床徴候を表すことができる。微生物の増殖を阻害する特定の化合物が存在する場合にはさらに、これらは、疾患の治療および予防における使用のために識別されてもよい。
The authors have nothing to disclose.
支援は実験室的方法の開発中にスコットトリース、Katelyn Arter、ジェレミーRagsdell、トニーLaMarkジェームズ、エイミー·フィッシャー、ハンナ·ブレア、そしてシャイアンジェルドによって提供された。 TLCスキャニングデンシトメトリーの支援のために、我々はメディナ·フエルテ研究所(アーカンソー州バイオサイエンス研究所·ルイス·H·NOPO-オラサバル)に感謝したいと思います。アーカンソー州バイオサイエンス研究所アーカンソーASSETイニシアティブP3センター(EPS-0701890):MALDI-TOF MSは、NSF EPSCoR、RIIを通して提供されたこのプロジェクトのために使用される。資金は米国漁業野生生物局/アーカンソー州野生生物グラント、国立洞窟学会、インディアナ州立大学の北米コウモリ調査と保護のためのセンターによって提供された。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals, LLC | 101162 | www.mpbio.com |
TLC Flexible Plates | Whatman | 4410-222 | www.whatman.com |
ACTH | Sigma-Aldrich Chem. Co. | A8346-5X1VL | www.sigmaaldrich.com |
Triolein | Sigma-Aldrich Chem. Co. | 44895-U | |
TLC Lipid Standard | TLC 18-1 | www.nu-chekprep.com | |
MALDI TAG Standard | Nu-Check Prep., Inc. | NIH Code 53B | |
MALDI TAG Standard | Sigma-Aldrich Chem. Co. | 17810-1AMP-S | |
Glass Vials with Teflon Cap | U.S. National Scientific Co. | B7800-2 | www.nationalscientific.com/ |
DHB | Sigma-Aldrich Chem. Co. | 50862-1G-F | |
CHCA | Sigma-Aldrich Chem. Co. | C8982-10X10 mg | |
Sebutape | CuDerm | S100 |