JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioingegneria

Порядок Создание многоуровневой углубленным круглым сечением Endothelialized Микроканалы-на-чипе

Published: October 21, 2013
doi:
10.3791/50771
, , ,
1Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering,West Virginia University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience,University of California at Riverside

Summary

Микроканалов-на-чипе платформа была разработана комбинация фотолитографическая reflowable технику фоторезиста, мягкой литографии и микрофлюидики. Endothelialized платформы микроканалов имитирует трехмерную (3D) геометрии в естественных условиях микрососудов, работает в контролируемых непрерывного потока перфузии, позволяет качественно и изображений в реальном времени и может быть применен для микрососудистых исследований.

Abstract

Усилия были сосредоточены на разработке в пробирке анализов для изучения микрососудов, потому что в естественных условиях исследования на животных более трудоемким, дорогим и наблюдения и количественной очень сложным. Однако, обычные в пробирке анализов микрососудов имеют ограничения при представлении в естественных условиях микрососудов по отношению к трехмерной (3D) геометрии и обеспечение непрерывного потока жидкости. Используя комбинацию фотолитографическая reflowable технику фоторезиста, мягкой литографии и микрофлюидики, мы разработали несколько глубине круглого поперечного сечения микроканалов endothelialized-на-чипе, которая имитирует 3D геометрии в естественных условиях микрососудов и работает под управлением контролируемого непрерывной перфузии потока. Положительный reflowable фоторезиста был использован для изготовления мастер-формы с полукруглое поперечное сечение микроканала сети. По выравнивание и соединение двух полидиметилсилоксана (PDMS) микроканалов REPLвыделенному из главной формы, цилиндрической микроканальной сеть была создана. Диаметры микроканалов может быть хорошо контролируются. Кроме того, первичных человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены (HUVECs) высевают в микросхеме показали, что клетки Вдоль внутренней поверхности микроканалов в контролируемых перфузии продолжительностью периода времени от 4 дней до 2 недель.

Introduction

Микрососуды, как часть системы кровообращения, опосредуют взаимодействие между крови и тканей, поддерживают метаболической активности, определяют ткани микросреду, и играют важную роль во многих здоровья и патологических состояний. Краткое изложение функциональных микрососудов в пробирке может обеспечить платформу для изучения сложных сосудистых явлений. Однако, обычные в пробирке анализов микрососудов, например, миграции эндотелиальных клеток анализы, анализы эндотелиальных формирования трубки и крысы и мыши анализов аорты кольцо, не в состоянии воссоздать в естественных условиях микрососудов в отношении трехмерной (3D) геометрии и непрерывный контроль потока 1-8. Исследования микрососудов с использованием животных моделей и в естественных анализов, таких как анализ ангиогенеза роговицы, хорионалантоисной мембраны ангиогенеза анализа и Матригель вилка анализа, более трудоемким, высокую стоимость, сложные по отношению к наблюдению и количественных иэтические вопросы, 1, 9-13.

Достижения в MicroManufacturing и микрожидкостной технологии чипа позволило различным понимание медико-биологических наук в то время как сокращение высоких экспериментальных затрат и сложностей, связанных с животными и в естественных условиях исследования 14, такие, как легко и жестко контролируется биологическими условиями и динамической жидкостной среды, который не будет иметь бы возможно при обычном макромасштабные методов.

Здесь мы представляем подход к построению endothelialized микроканалов-на-чипе который имитирует 3D геометрии в естественных условиях микрососудов и работает под управлением контролируемого непрерывного потока перфузии с помощью сочетания фотолитографическая reflowable технику фоторезиста, мягкой литографии и микрофлюидики.

Protocol

1. Изготовление фотолитографии фоторезиста Master Mold Следующий протокол показан процесс для изготовления микроканалов с диаметром 30-60 мкм. Чтобы получить микроканальной с меньшим диаметром (менее 30 мкм), одну спин-покрытия фоторезиста необходимо. Передача оплавлени?…

Representative Results

Наш подход для изготовления нескольких глубины микроканальной сеть имитирует сложные 3D геометрии в естественных условиях микрососудов, в котором микроканалов имеют закругленные сечений 15. Кроме того, диаметры родителей ветвления каналов и каналов дочь примерно подчиняют?…

Discussion

1. Мастер изготовления форм

Один из проектирования и руководящих принципов сосудистой морфометрией известен как закон Мюррея 16, в котором говорится, что распределение диаметре сосудов по всей сети регулируется минимальная рассмотрения энергии. В нем также гово?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было частично поддержана Национальным научным фондом (NSF 1227359), WVU EPSCoR программы, финансируемой Национальным научным фондом (EPS-1003907), WVU ADVANCE офиса под эгидой Национального научного фонда (1007978), и WVU PSCoR соответственно. Микротехнологий работа была проделана в WVU общих исследовательских сооружений (чистых помещений объектов) и интегративной Микрофлюидных сотовой исследований на кристалле лаборатории (Microchip Lab) в Университете Западной Вирджинии. Конфокальной микроскопии было сделано в Западной Вирджинии фонда визуализации микроскопа.

Materials

Reagent/Material
Reflow Photoresist AZ Electronic Materials AZP4620
Developer AZ Electronic Materials AZ 400K
PDMS Dow Corning Corporation Sylgard 184
MCDB 131 Culture Medium Invitrogen 10372-019
NacBlue Nuclei Staining Invitrogen H1399
PKH Red Stain Sigma MINI26 and PKH26GL
Fibronectin Gibco PHE0023
L-Glutamine Sigma G7513
Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14040-133
HEPES Buffered Saline Solution Lonza CC-5024
Trypsin/EDTA Invitrogen 25300-062
Trypsin Neutralizing Solution Lonza CC-5002
PDMS Curing Agent Dow Corning Corporation Sylgard 184
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells Lonza CC-2517
Fetal Bovine Serum Lonza 14-501F
Diluent C Sigma CGLDIL
Hoechst33342 Invitrogen, Molecular Probes R37605
Dextran Sigma 95771
3.5% Paraformaldehyde Electron Microscopy Science 15710-S
Equipment
Spinner Laurell Technologies Corporation WS-400BZ-6NPP/LITE
Desiccator BelArt Products 999320237
Inverted Microscope Nikon Eclipse Ti
Syringe Pump System Harvard Apparatus PHD Ultra
Laminar Biosafety Hood Thermo Scientific 1300 Series A2
Planetary Centrifugal Mixer Thinky ARE-310
Isotemp Oven Fisher Scientific 13-246-516GAQ
Optical Microscope Zeiss Invertoskop 40C
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Hotplate Barnstead/Thermolyne Cimarec SP131635
Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss LSM 510
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Adair, T. H. . Angiogenesis: Integrated systems physiology: from molecule to function to disease. , (2011).
  2. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, 172-183 (2007).
  3. Smith, E. J., Staton, C. A. Tubule formation assays. Angiogenesis assays: A critical appraisal of current techniques. , 65-87 (2006).
  4. Nakatsu, M. N., Davis, J. J., Hughes, C. C. W. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
  5. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab. Invest. 63, 115-122 (1990).
  6. Aplin, A. C., Fogel, E., Zorzi, P., Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 119-136 (2008).
  7. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: A quarter century of search and discovery. J. Cell. Mol. Med. 13, 4113-4136 (2009).
  8. Griffith, L. G., Swart, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 211-224 (2006).
  9. Folkman, J. History of angiogenesis. Angiogenesis: An integrative approach from science to medicine. , (2008).
  10. Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: A critical overview. Clin. Chem. 49, 32-40 (2003).
  11. Auerbach, R., Akhtar, N., Lewis, R. L., Shinners, B. L. Angiogenesis assays: Problems and pitfalls. Cancer Metastasis Rev. 19, 167-172 (2000).
  12. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
  13. Staton, C. A., Stribbling, S. M., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int. J. Exp. Pathol. 85, 233-248 (2004).
  14. Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-Chip: A focus on compartmentalized microdevices. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
  15. Huang, Z., Li, X., Martins-Green, M., Liu, Y. Microfabrication cylindrical microfluidic channel networks for microvascular research. Biomedical Microdevices. 14 (5), 873-883 (2012).
  16. Murray, C. D. The physiological principle of minimum work applied to the angle of branching of arteries. J. Gen. Physiol. 9 (6), 835-841 (1926).
  17. Zamir, M., Medeiros, J. A. Arterial branching in man and monkey. J. Gen. Physiol. 79, 353-360 (1982).
  18. Gafiychuk, V. V., Lubashevsky, I. A. On the principles of the vascular network branching. J. Theor. Biol. 212, 1-9 (2001).
  19. Sherman, T. F. On connecting large vessels to small. The meaning of Murray’s law. J. Gen. Physiol. 78 (4), 431-453 (1981).
  20. Kamiya, A., Bukhari, R., Togawa, T. Adaptive regulation of wall shear stress optimizing vascular tree function. Bull Math Biol. 46 (1), 127-137 (1984).
  21. LaBarbera, M. Principles of design of fluid transport systems in zoology. Science. 249, 992-1000 (1990).
  22. Emerson, D. R., Cieslicki, K., Gu, X., Barber, R. W. Biomimetic design of microfluidic manifolds based on a generalized Murray’s law. Lab Chip. 6, 447-454 (2006).
  23. Lu, H., Koo, L. Y., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal. Chem. 76, 5257-5264 (2004).
  24. Shevkoplyas, S. S., Gifford, S. C., Yoshida, T., Bitensky, M. W. Prototype of an in vitro model of the microcirculation. Microvasc. Res. 65, 132-136 (2003).
  25. Kaihara, S., Borenstein, J., et al. Silicon micromachining to tissue engineer branched vascular channels for liver fabrication. Tissue Eng. 6, 105-117 (2000).
  26. Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 281 (3), L529-L533 (2001).
  27. Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
  28. Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1 (8), 759-766 (1990).
  29. Schilling, A., Merz, R., Ossmann, C., Herzig, H. P. Surface profiles of reflow microlenses under the influence of surface tension and gravity. Opt. Eng. 39 (8), 2171-2176 (2000).
  30. Young, B., Heath, J. W. . Wheater’s functional histology: A text and colour atlas. , (2000).
  31. O’Neill, F. T., Sheridan, J. T. Photoresist reflow method of microlens production. Part 1: Background and experiments. Optik Int. J. Light Electron Opt. 113, 391-404 (2002).
  32. de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Rev. Mod. Phys. 57, 827-863 (1985).
  33. Elias, H. G. . An Introduction to Polymer Science. , (1997).
  34. Voinov, O. V. Dynamic edge angles of wetting upon spreading of a drop over a solid surface. J. Appl. Mech. Tech. Phys. 40, 86-92 (1999).
  35. Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1, 759 (1990).
  36. Jay, T. R., Stern, M. B. Preshaping photoresist for refractive microlens fabrication. Opt. Eng. 33, 3552-3555 (1994).
  37. Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The Study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
  38. Chien, S., Li, S., Shyy, Y. J. Effects of mechanical forces on signal transduction and gene expression in endothelial cells. Hypertension. 31, 162-169 (1998).
  39. Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
  40. Lee, E. J., Vunjak-Novakovic, G., Wang, Y., Niklason, L. E. A biocompatible endothelial cell delivery system for in vitro tissue engineering. Cell Transplant. 18, 731-743 (2009).
  41. Lee, E. J., Niklason, L. E. A novel flow bioreactor for in vitro microvascularization. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 1191-1200 (2010).
  42. Chau, L., Doran, M., Cooper-White, J. A novel multishear microdevice for studying cell mechanics. Lab Chip. 9, 1897-1902 (2009).
  43. Meeson, A., Palmer, M., Calfon, M., Lang, R. A relationship between apoptosis and flow during programmed capillary regression is revealed by vital analysis. Development. 122, 3929-3938 (1996).
  44. Van Royen, N. J., Piek, J., Schaper, W., Bode, C., Buschmann, I. Arteriogenesis: mechanisms and modulation of collateral artery development. J. Nucl. Cardiol. 8, 687-693 (2001).
  45. Schaper, W. Therapeutic arteriogenesis has arrived. Circulation. 104 (17), 1994-1995 (2001).
  46. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovas. Res. 87 (2), 320-330 (2010).
  47. Potter, C. M., Lundberg, M. H., et al. Role of shear stress in endothelial cell morphology and expression of cyclooxygenase isoforms. Arterioscler. Thromb. Vasc Biol. 31, 384-391 (2011).
  48. Montesano, R. In vitro rapid organization of endothelial cells into capillary-like networks is promoted by collagen matrices. J. Cell Biol. 97, 1648-1652 (1983).
  49. Darland, D. C., D’Amore, P. A. TGF beta is required for the formation of capillary-like structures in three-dimensional cocultures of 10T1/2 and endothelial cells. Angiogenesis. 4 (1), 11-20 (2001).
  50. Lawley, T. J., Kubota, Y. Induction to morphologic differentiation of endothelial cells in culture. J. Invest. Dermatol. 93, 59S-61S (1989).
  51. Kanzawa, S., Endo, H., Shioya, N. Improved in vitro angiogenesis model by collagen density reduction and the use of type III collagen. Ann. Plast. Surg. 30, 244-251 (1993).
  52. Davis, G. E., Bayless, K. J., Mavila, A. Molecular basis of endothelial cell morphogenesis in three-dimensional extracellular matrices. Anat. Rec. 268, 252-275 (2002).
  53. Velazquez, O. C., Snyder, R., Liu, Z., Fairman, R. M., Herlyn, M. Fibroblast-dependent differentiation of human microvascular endothelial cells into capillary-like 3-dimensional networks. FASEB J. 16, 1316-1318 (2002).
  54. Donovan, D., Brown, N. J., Bishop, E. T. Comparison of three in vitro human “angiogenesis” assays with capillaries formed in vivo. Angiogenesis. 4, 113-121 (2001).
  55. Tang, D. G., Conti, C. J. Endothelial cell development, vasculogenesis, angiogenesis, and tumor neovascularization: an update. Semin. Thromb. Hemost. 30, 109-117 (2004).
  56. Takayama, S., McDonald, J. C., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5545-5548 (1999).
  57. Cho, B. S., Schuster, T. G., et al. Passively driven integrated microfluidic system for separation of motile sperm. Anal. Chem. 75, 1671-1675 (2003).
  58. Parsa, H., Upadhyay, R., Sia, S. K. Uncovering the behaviors of individual cells within a multicellular microvascular community. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (12), 5133-5138 (2011).

Tags

Keywords: Multi-depth Circular Cross-sectional MicrochannelsEndothelialized MicrochannelsIn Vitro Microvessels3D GeometryContinuous Fluid FlowPhotolithographic ReflowSoft LithographyMicrofluidicsPDMSPrimary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)Perfusion
check_url/it/50771?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Li, X., Mearns, S. M., Martins-Green, M., Liu, Y. Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip. J. Vis. Exp. (80), e50771, doi:10.3791/50771 (2013).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image