Mikrofluidik-On-Chip-Capture-Cycloaddition reversibel Unbeweglichkeitseffekt kleine Moleküle oder Mehrkomponenten-Strukturen für Biosensor-Anwendungen
Summary
Wir präsentieren eine Methode für die schnelle, reversible Immobilisierung von kleinen Molekülen und funktionalisierte Nanopartikel Baugruppen für die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Studien mit sequentiellen On-Chip-Cycloaddition bioorthogonale Chemie und Antikörper-Antigen-Capture.
Abstract
Methoden für die schnelle Oberfläche Immobilisierung von bioaktiven kleinen Molekülen mit der Kontrolle über Orientierung und Immobilisierungsdichte für Biosensor und Microarray-Anwendungen sehr wünschenswert. In dieser Studie verwenden wir eine hocheffiziente kovalente bioorthogonale [4 +2]-Cycloaddition zwischen trans-Cycloocten (TCO) und 1,2,4,5-Tetrazins (Tz), um den mikrofluidischen Immobilisierung von TCO / Tz-derivatisierten Moleküle ermöglichen . Wir überwachen den Prozess in Echtzeit unter Dauerdurchflussbedingungen mit Oberflächenplasmonresonanz (SPR). Reversible Immobilisierung zu ermöglichen und sich die experimentellen Bereich der Sensorfläche verbinden wir eine nicht-kovalente Antigen-Antikörper-Einfang-Komponente mit der Cycloaddition. Durch abwechselndes präsentiert TCO oder Tz Einheiten an die Sensoroberfläche, mehrere Capture-Cycloadditionen nun auf einer Sensoroberfläche für On-Chip-Aufbau und Wirkungsstudien zu einer Vielzahl von Mehrkomponentenstrukturen. Wir illustrate dieses Verfahren mit zwei verschiedenen Experimenten Immobilisierung auf einem Biosensorchip, ein kleines Molekül, AP1497, die FK506-bindendes Protein 12 (FKBP12) bindet und die gleiche kleine Molekül als Teil eines immobilisierten und in situ-funktionalisierten Nanopartikel.
Introduction
Effizienten Konjugationsreaktionen sind wertvolle Werkzeuge für die Befestigung bioaktiver Moleküle auf Oberflächen für eine Vielzahl von Anwendungen der Biotechnologie. Vor kurzem hat die sehr schnell bioorthogonale [4 +2]-Cycloaddition zwischen trans-Cycloocten (TCO) und 1,2,4,5-Tetrazins (Tz) wurde verwendet, um Zelloberflächen subzellulärer Strukturen, Antikörpern und Nanopartikeln zu markieren ein. – 7 Hier verwenden wir die [4 +2]-Cycloaddition in Verbindung mit Antigen / Antikörper-Capture (GST / anti-GST) für reversible on-Chip-Synthese von Mehrkomponenten-Strukturen für die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Interaktionsanalyse und Überwachung der Prozess in Echtzeit (Abbildung 1). 8,9 Insbesondere die Einnahme-Cycloaddition Strategie ermöglicht Regeneration Oberfläche mit einem festgelegten Protokoll. 8 Als Folge Montage stabile Sensorflächen mit der Kontrolle über Liganden Orientierung und Dichte für eine Vielzahl von neuen Tests Formate ist nun möglich. MitDiese Strategie, die wir zeigen die Immobilisierung von TCO / Tz-derivatisierten kleine Moleküle und zeichnen die Cycloaddition Raten in einer Vielzahl von Pufferbedingungen. Wir wählten die bekannte Interaktion zwischen FKBP12 und einem Molekül, das AP1497 10-12 FKBP12 bindet, als ein Beispiel, um zu überprüfen, dass das Capture-Cyclo Strategie erhält die Fähigkeit des kleinen Moleküls um sein Ziel zu interagieren, wenn entweder direkt an immobilisierte GST-Antigene gebunden oder immobilisiert Nanopartikel (NP).
Dieses Verfahren bietet mehrere Vorteile. Zuerst wird nun die reversible Immobilisierung von kleinen Molekülen auf Sensorchips möglich. Zweitens TCO / Tz Immobilisierung kleiner Moleküle ermöglicht auch markierungsfreie Interaktionsstudien, die die Ausrichtung der kanonischen SPR Studien umzukehren, und kann eine komplementäre Ansicht eines Bindungswechsel bieten. Drittens, ermöglicht dieses Verfahren die mikrofluidische Synthese gezielt Nanopartikel und sofortige Auswertung ihrer Binding Eigenschaften. Dies verspricht, die Effizienz der Auswertung oder Screening-Nanopartikel gezielt zu verbessern und auch eine Verringerung der Mengen von Nanopartikeln erforderlich. 13-15 Viertens, kann dieser Ansatz die Reaktionskinetik der bioorthogonale Cycloadditionsreaktionen in Echtzeit unter Dauerstrom zu messen. Schließlich ist die TCO / Tz Immobilisierung Chemie in Gegenwart von Serum robust. Insgesamt erwarten wir, dass dieses vielseitige Ansatz wird allgemein erleichtern Aufbau stabiler Sensorflächen für eine Vielzahl von mikrofluidischen Studien mit Relevanz für die in-vitro-und in-vivo-Zellanwendungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene Methode Capture-Cycloaddition ermöglicht eine schnelle, reversible Immobilisierung von modifizierten Nanopartikeln und kleine Moleküle für markierungsfreie Chip-basierte Interaktion und kinetische Untersuchungen. Die Immobilisierung Protokoll kann in Minuten erfordern <10 uM Konzentrationen von niedermolekularen Liganden durchgeführt werden. Durch Modulation Liganden-Konzentration und Kontaktzeit Immobilisierung Dichten genau kontrolliert werden. Unsere Daten zeigen, dass auf dem Chip bioort…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir erkennen die Finanzierung von NIH (NHLBI Vertrag Nr. HHSN268201000044C Rw, SH und SYS).
Materials
| Reagent | |||
| Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1005-30 | |
| Amine coupling kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| GST capture kit | GE Healthcare | BR-1002-23 | |
| NAP-10 Columns | GE Healthcare | 17-0854-01 | |
| GST, lyophilized in 1X PBS | Genscript | Z02039 | 1 mg/ml |
| rhFKBP12 | R&D Systems | 3777-FK | |
| Surfactant P-20 | GE Healthcare | BR-1000-54 | |
| Glycine 2.0 | GE Healthcare | BR-1003-55 | |
| Zeba spin desalting column | Thermo | 89882 | 7 K MWCO |
| Amicon Ultra 4 | Fisher | UFC810096 | 100 K centrifugal filter |
| TCO-OH | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| TCO-NHS | Ref. 8 | Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25 | |
| Tz-BnNH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Tz-NHS | Ref. 8 | 764701 | Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701 |
| NP-NH2 = CLIO-NH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| AP1497, AP1497-Tz | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Equipment | |||
| SPR Biosensor | GE Healthcare | Biacore T100 |
Riferimenti
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