Summary
We presenteren een methode voor een snelle, omkeerbare immobilisatie van kleine moleculen en gefunctionaliseerde nanodeeltjes assemblages voor Surface Plasmon Resonance (SPR) studies, met behulp van sequentiële on-chip bioorthogonal cycloadditiereactie chemie en antilichaam-antigen capture.
Abstract
Methodes voor snelle oppervlakte immobilisatie van bioactieve kleine moleculen met controle over de oriëntatie en immobilisatie dichtheid zijn zeer wenselijk voor biosensor en microarray toepassingen. In deze studie, gebruiken we een zeer efficiënte covalente bioorthogonal [4 +2] cycloadditie reactie tussen trans-cyclo (TCO) en 1,2,4,5-tetrazine (Tz) de microfluïdische immobilisatie van TCO / Tz-gederivatiseerde moleculen inschakelen . We volgen het in real time onder continue stroomomstandigheden behulp van oppervlakte-plasmon resonantie (SPR). Omkeerbare immobilisatie inschakelen en verlengen de experimentele bereik van het sensoroppervlak combineren we een niet-covalente antigeen-antilichaam koolstofafvangcomponent de cycloadditiereactie. Door afwisselend presenteren TCO of Tz groepen aan het sensoroppervlak, verschillende capture-cycloadditie processen nu mogelijk aan een sensoroppervlak voor on-chip montage en interactie studies van een groot aantal multi-component structuren. We illustrate deze methode met twee verschillende experimenten immobilisatie op een biosensor chip, een klein molecuul, dat AP1497-FK506 bindend eiwit 12 (FKBP12) bindt, en dezelfde kleine moleculen als deel van een geïmmobiliseerd en in situ gefunctionaliseerde nanodeeltjes.
Introduction
Efficiënte conjugatiereacties zijn waardevolle hulpmiddelen voor het bevestigen van bioactieve moleculen aan oppervlakken voor diverse biotechnologische toepassingen. Onlangs heeft de zeer snelle bioorthogonal [4 +2] cycloadditiereactie tussen trans-cycloocteen (TCO) en 1,2,4,5-tetrazine (Tz) gebruikt om celoppervlak, subcellulaire structuren, antilichamen en nanodeeltjes label 1. - 7 Hier gebruiken we de [4 +2] cycloadditie reactie in combinatie met antigen / antilichaam-capture (GST / anti-GST) voor wisselbaar-chip synthese van multi-component structuren Surface Plasmon Resonance (SPR) interactie analyse en bewaken van de proces in real-time (figuur 1). 8,9 name de capture-cycloadditie strategie maakt oppervlak regeneratie met behulp van een vooraf vastgesteld protocol. 8 Als gevolg, assemblage van stabiele sensor oppervlakken met controle over ligand oriëntatie en dichtheid voor tal van nieuwe assay formaten is nu mogelijk. Gebruikdeze strategie laten we de immobilisatie van TCO / Tz-gederivatiseerde kleine moleculen karakteriseren cycloadditie prijzen in verschillende buffer omstandigheden. We kozen voor het bekende interactie tussen FKBP12 en een molecuul AP1497 dat FKBP12 10-12 bindt als een voorbeeld om na te gaan of de capture-cycloadditie strategie behoudt het vermogen van de kleine molecule om te communiceren met de doelgroep wanneer hetzij rechtstreeks aangesloten op geïmmobiliseerde GST antigenen of aan geïmmobiliseerd nanodeeltjes (NP).
Deze methode biedt een aantal voordelen. Ten eerste, de omkeerbare immobilisatie van kleine moleculen op sensorchips is nu mogelijk. Ten tweede, TCO / Tz immobilisatie van kleine moleculen maakt ook label-free interactiestudies dat de oriëntatie van canonieke SPR studies te keren, en kunnen een aanvullende weergave van een bindende interactie. Ten derde, deze methode kan de microfluïdische synthese van gerichte nanodeeltjes en onmiddellijke evaluatie van de binding eigenschappen. Dit belooft de efficiëntie te evalueren of screenen gericht nanoparticles verbeteren en tevens de hoeveelheid nanodeeltjes vereist verminderen. 13-15 vierde kan deze benadering de reactiekinetiek van bioorthogonal cycloadditiereacties meten realtime onder continue stroom. Ten slotte TCO / Tz immobilisatie chemie is robuust in aanwezigheid van serum. Samengevat, verwachten we dat deze veelzijdige benadering constructie van stabiele sensor oppervlakken uiteenlopende microfluïdische studies relevante in vitro en in vivo cellulaire toepassingen algemeen zal vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van GST en Nanoparticle (NP) Stamverwanten
- GST-TCO voorbereiding:
- Voeg 8 ul van TCO-NHS-oplossing (50 mM in DMSO) en 100 gl GST (1 mg / ml in PBS) en schud het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Verwijder overtollig reagens met een Zeba draai ontzoutingskolom. Het gewonnen filtraat dat het GST-TCO conjugaat wordt bewaard bij 4 ° C vóór gebruik.
- GST-Tz voorbereiding:
- Voeg 6 pl Tz-NHS-oplossing (25 mM in DMF) 75 gl GST (1 mg / ml in PBS) en schud het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Verdun het reactiemengsel met 25 pi PBS en zuiveren met behulp van een spin ontzoutingskolom. Het filtraat dat het GST-Tz conjugaat wordt bewaard bij 4 ° C vóór gebruik.
- NP-TCO voorbereiding:
- Voeg 100 ul van TCO-NHS-oplossing (50 mM in DMSO) te150 ui geamineerde nanodeeltjes (NP-NH2, 8,7 mg Fe / ml in PBS, 3 nm ijzerkern ~ 8000 Fe / NP) en schud mengsel bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Verwijder overtollig reagens door gelfiltratie gebruik van een NAP-10-kolom geëlueerd met PBS-buffer. Verzamel de gekleurde band met de NP-TCO product.
- Concentreer het filtraat in tot een eindvolume van ~ 150 ul met behulp van een centrifugale filterinrichting (100 k MWCO).
- Voeg 50 ul van barnsteenzuuranhydride (0,1 M in DMSO) aan de NP-TCO-oplossing en schud bij kamertemperatuur gedurende 1 uur (anhydride reageert met de resterende aminen terminale carbonzuren vormen. Dit voorkomt niet-specifieke interacties met het dextran oppervlak).
- Zuiver het NP-TCO product gebruik van een NAP-10 kolom elueren met PBS. Bewaar de oplossing van NP-TCO bij 4 ° C vóór gebruik.
2. Voorbereiding van de oppervlakte
Alle oppervlakteplasmonresonantie testen worden uitgevoerd op een Biacore T100 instrument (GE Healthcare) bij25 ° C met een CM5 sensorchip en PBS-P als loopbuffer tenzij anders vermeld. Biacore Controle en evaluatie software met het instrument meegeleverd worden ingezet voor het opzetten van experimenten en het analyseren van gegevens. Twee modi, de toepassing wizards en handmatige termijn zal worden gebruikt voor de voorbehandeling van het oppervlak en het toezicht op de chip capture-cycloadditie. Werkwijze builder mode wordt gebruikt voor het opzetten omgekeerde oriëntatie bindingsexperimenten en het meten cycloadditiereactie tarieven. Gegevens zijn dubbele verwijzing afgetrokken en kinetische analyses worden uitgevoerd met behulp van een 1:1 Langmuir bindend model.
- Gebruik de amine immobilisatie tovenaar sjabloon en selecteer immobilisatie op Flow cellen 1 (referentie) en 2 (detectie). Pas amine methode oppervlak carboxylgroepen geactiveerd door injectie van een 1:1 oplossing van 0,4 M EDC: 0,1 M NHS gedurende 480 seconden bij een stroomsnelheid van 10 pl / min. Stel de injectie van ethanolamine om de resterende geactiveerde esters tot 420 sec contacttijd lessen opeen stroomsnelheid van 10 pl / min.
- Input ligand naam, anti-GST (18 ug / ml in acetaatbuffer, pH 5,0) en stel injecteren een contacttijd van 420 sec bij een stroomsnelheid van 10 pl / min.
- Plaats vereiste oplossing flacons in reagens rek 2 en zorg ervoor dat de standpunten met de inhoud lijst passen. Opslaan en start immobilisatie.
Opmerking: Het uitvoeren van de immobilisatie wizard deze manier leidt tot anti-GST immobilisatie niveaus in het bereik van ~ 14.000 tot 17.000 RU. - Bewerk de immobilisatie wizard om alleen te injecteren GST ligand (20 ug / ml) oplossing voor 420 sec bij 5 pl / min meer dan verwijzing Flow cel 1.
3. Monitoring On-chip Capture-cycloadditie van gefunctionaliseerde moleculen
- Monitoring on-chip capture-cycloadditiereactie in real-time (figuur 2).
- Plaats GST-TCO (20 ug / ml), Tz-BnNH 2 (10 uM) en regeneratie (10 mM glycine, pH = 2,0) oplossing in flesjes reagens rek 2. Selecteer de manUAL run methode, stelt het debiet tot 5 pl / min en stromen weg naar cel 2 Flow.
- Injecteren oplossing van GST-TCO voor 420 sec.
- Injecteer oplossing van Tz-BnNH 2 600 sec.
- Regenereren het oppervlak met twee 30 sec injecties van regeneratie oplossing.
- Monitoring on-chip montage van meerdere componenten structuren realtime (Figuur 3):
- Plaats GST-Tz (20 ug / ml), NP-TCO (100 ug Fe / ml), Tz-BnNH 2 (10 uM) en regeneratie (10 mM glycine, pH = 2,0) oplossing in flesjes reagens rek 2. Selecteer het instrument handmatig run methode, stelt het debiet tot 5 pl / min en de stroom weg naar cel 2 Flow.
- Injecteer een oplossing van GST-Tz voor 60 sec.
- Injecteer een oplossing van NP-TCO voor 60 sec.
- Injecteer een oplossing van Tz-BnNH 2 voor 60 sec.
- Regenereren het oppervlak met twee 30 sec injecties van regeneratie oplossing.
4. MMonitoring van immobilisatie Dichtheid en Bepaling van Cycloadditiereacties tarieven
- Karakterisering van kleine molecule cycloadditiereactie tarieven (figuur 4).
- Selecteer nieuwe methode en input algemene parameters. In het panel test stappen maak een nieuwe stap en noem deze Sample. Stel het doel en Connect basisinstellingen te proeven.
- In het panel Cycle Soorten Maak een nieuwe cyclus stap en voeg de volgende opdrachten, Capture, Sample, Regeneratie 1 en Regeneratie 2.
- Selecteer de opdracht Capture; ingang ligand naam (GST-TCO, 20 ug / ml), contacttijd 120 sec bij 5 pl / min en stel stroomweg naar: Second. Selecteer de Sample commando; ingang 180 sec contacttijd, 60 sec dissociatie tijd, 30 pl / min debiet en zet stroomweg naar: Beide. Selecteer de Regeneration 1 commando; ingang regeneratieoplossing naam (10 mM glycine-HCl pH 2,0), contacttijd van 30 seconden bij 30 pl / min en stel stroomweg naar: Second. Herhaal hetzelfde voor Regeneratie 2 commando. </ Li>
- Selecteer Setup Uitvoeren en stel stroomweg aan: 2-1. Kies volgende en vul monster lijst met analytoplossing (Tz-BnNH 2) en concentratie series (0.3-10 uM, 1:02 verdunning). Selecteer naast rack positie paneel. Plaats oplossing flacons in reagens rek 2 en verdunningsreeks in 96-well plaat en zorg ervoor dat de standpunten met de inhoud lijst passen. Opslagmethode template en start bindingassay. Bindingsgegevens en kinetische analyse worden getoond in Figuur 4.
- Karakterisering van NP cycloadditiereactie tarieven (figuur 4).
- Open het opgeslagen methode sjabloon van boven en verander de volgende parameters. Selecteer het paneel Capture; verandering ligand naam aan GST-Tz, 20 ug / ml. Selecteer het voorbeeld paneel; verandering contacttijd tot 120 sec contacttijd en dissociatie tijd tot 120 sec.
- Selecteer de sample lijst; analyt veranderen in NP-TCO en concentratie series (7-224 nM, 1:02 verdunning). Plaats oplossing flacons in reagens rack2 en verdunning serie in 96-well plaat en zorg ervoor dat de standpunten met de inhoud lijst passen. Opslagmethode template en start bindingassay. Bindingsgegevens en kinetische analyse worden getoond in Figuur 4.
5. Het meten van de binding van FKBP12 aan geïmmobiliseerd AP1497
Omgekeerde oriëntatie binding studies met FKBP12 de analyt en samengestelde AP1497 als geïmmobiliseerde ligand (Figuur 5). De algemene methode voor deze test wordt als volgt met behulp van de methode builder tool opgezet:
- Selecteer nieuwe methode en input algemene parameters. In het panel test stappen maken en een naam Capture, Sample and Regeneration stappen. Selecteer het corresponderende Doel en aansluiten basisinstellingen.
- Selecteer panel Cycle Types en maak 3 cyclus stappen: Vastleggen, Sample and Regeneration.
- Plaats de opdracht Capture tweemaal onder Capture cyclus stap. Selecteer Capture 1 paneel en selecteer capture oplossing als variable Stel contacttijd 300 sec bij een stroomsnelheid van 5 pl / min en stel stroompad: Second. Selecteer het paneel Vastleggen 2 en selecteert capture oplossing variabele ingesteld contacttijd 250 sec bij een stroomsnelheid van 5 pl / min en stel stroompad: Second.
- Plaats de Sample commando onder de Sample cyclus stap. Selecteer het voorbeeld paneel; set contacttijd tot 60 sec, dissociatie tijd tot 200 sec bij een stroomsnelheid van 30 pl / min en stel stroomweg naar: Beide.
- Plaats de Regeneratie commando twee keer onder de Regeneratiecyclus stap. Selecteer de Regeneration 1 paneel; ingang regeneratieoplossing naam (10 mM glycine-HCl pH 2,0), contacttijd van 30 seconden bij 30 pl / min en stel stroomweg naar: Second. Herhaal hetzelfde voor het paneel Regeneration 2.
- Selecteer Setup Uitvoeren en stel stroomweg aan: 2-1. Kies volgende en input capture oplossing namen (GST-TCO en AP1497-Tz), monster naam (FKBP12), concentratie-serie (,020-5 ug / ml, 1:02 verdunning) en MW (13.000). Plaats oplossing flacons in reagent rack 2 en verdunningsreeks in 96-well plaat en zorg ervoor dat de standpunten met de inhoud lijst passen. Opslagmethode template en start bindingassay. Kinetische analyse gegevens worden getoond in figuur 5.
6. Het meten van de binding van FKBP12 tot AP1497 Gehecht aan geïmmobiliseerd NP
De algemene methode voor de nanodeeltjes immobilisatie, klein molecuul derivatisering en FKBP12 bindingstest wordt als volgt met behulp van de methode builder tool set-up:
- Open het opgeslagen methode sjabloon van boven en aan te passen. Plaats een extra Capture commando onder Capture cyclus stap. Selecteer de Capture 1 paneel; deselecteren capture oplossing als variabele en de naam capture oplossing 1 (GST-Tz). Stel contacttijd tot 60 sec bij een stroomsnelheid van 5 pl / min en stel stroompad Second. Selecteer de Capture 2 paneel; deselecteren capture oplossing als variabele en de naam capture oplossing 2 (NP-TCO). Stel contacttijd tot 90 sec bij een stroomsnelheid van 5 pl / min eningesteld stroomweg naar tweede. Selecteer de Capture 3 paneel; deselecteren capture oplossing als variabele en de naam capture oplossing 3 (AP1497-Tz). Stel contacttijd 180 sec bij een stroomsnelheid van 5 pl / min en stel stroompad Second.
- Selecteer Setup Uitvoeren en stel stroomweg aan: 2-1. Kies volgende keer. Plaats oplossing flacons in reagens rek 2 en verdunningsreeks in 96-well plaat en zorg ervoor dat de standpunten met de inhoud lijst passen. Opslagmethode template en start bindingassay. Kinetische analyse gegevens worden getoond in figuur 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gegevens en cijfers zijn op basis van referentie 8.
Efficiënte omkeerbare immobilisatie van biologisch werkzame kleine moleculen met controle over de oriëntatie en dichtheid speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van nieuwe biosensor toepassingen. De snelle bioorthogonal reactie tussen TCO en Tz beschrijven we een werkwijze voor de stapsgewijze assemblage en regeneratie van ligand oppervlakken met behoud van biologische activiteit. Figuur 2 toont de real-time monitoring van Tz-BnNH 2 immobilisatie. Een oplossing van GST-TCO wordt geïnjecteerd via een pre-geïmmobiliseerde anti-GST oppervlak waardoor ~ 400 RU stijging reactie. Een tweede injectie Tz-BnNH 2 een snelle ~ 15 RU stijging reactie. Geen dissociatie van de gederivatiseerde antigeen wordt waargenomen nadat overgeschakeld naar lopende buffer bewijs voor structuur stabiliteit. Het oppervlak wordt geregenereerd in de laatste stap van de cyclus om meerdere capture-cycloaddities cycli mogelijk te maken. Onsing procedure en vervangen Tz-BnNH 2 groep met AP1497-Tz molecuul genereert een bioactief oppervlak voor interactie onderzoeken met zijn doel FKBP12 (Figuur 5). Verstoring van het antilichaam / antigeen interacties (zie figuur 2) regenereert het anti-GST oppervlak, waardoor een nieuwe moleculaire samenstel te bouwen. In dit geval wordt een GST-Tz injectie (vangst van ~ 800 RU) gevolgd door een injectie van NP-TCO (cycloadditie ~ 600 RU), effectief immobiliseren van de nanodeeltjes op het sensoroppervlak (figuur 3). Ongereageerde TCO groepen op de NP zijn beschikbaar voor cycloadditiereactie met geïnjecteerde Tz-BnNH 2 (~ 22 RU). Alternatief is AP1497-Tz gebruikt gefunctionaliseerde nanodeeltjes FKBP12-interacties (figuur 5) volgen. Geen dissociatie van de multi-component structuren (GST-Tz/NP-TCO/Tz-BnNH 2) worden waargenomen bewijs voor stabiliteit en bioactiviteit structuur (AP1497-Tz/FKBP12 bINDENDE).
Met mogelijkheden voor real-time immobilisatie (cycloadditiereactie) reactie monitoring en oppervlak regeneratie, de eenvoudige karakterisering van de vereniging tarief k een (cycloadditiereactie tarief) wordt uitgevoerd zoals weergegeven in figuur 4. Kennis van de kinetiek geeft richtlijnen voor het regelen van immobilisatie dichtheid (contacttijd en concentratie), een belangrijke parameter voor biosensor assays. Injecteren van toenemende concentraties van Tz-BnNH 2 of NP-TCO in tweevoud op GST-TCO of GST-TZ oppervlakken, respectievelijk genereert de bindende gegevens (rode lijnen). De bindende gegevens voor twee opeenvolgende analyseren monsters van dezelfde concentratie op hetzelfde oppervlak zijn bijna superponeerbare weerspiegelen minimaal verlies van antilichaam bindend vermogen als gevolg van meerdere cycli van capture-cycloadditiereactie en regeneratie. De evaluatie software biedt de best passende kinetische analyses (zwarte lijnen ) voor de cycloaddition reactiesnelheden k een figuur 4.
Figuur 1. Bioorthogonal vervoeging strategie voor de omkeerbare immobilisatie van gederivatiseerde moleculen. A. [4 +2] cycloadditiereactie tussen trans-cycloocteen (TCO) en 1,2,4,5-tetrazine (Tz) resten van de 1,4-dihydropyridazine adduct geven . B. Experimentele regeling voor omkeerbare immobilisatie van Tz / TCO gemerkte moleculen. C. Experimentele regeling voor omkeerbare nanodeeltjes immobilisatie en functionalisering. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. . Real-time monitoring van kleine molecule immobilisatie 1) Baseline:. Pre-geïmmobiliseerde anti-GST 2) Vastleggen van geïnjecteerd GST-TCO door anti-GST antilichaam (t = 0-420 sec), gevolgd door injectie van het runnen van buffer (t . = 420-540 sec) toont persistentie van interactie 3) Cycloadditiereacties tussen vastgelegde GST-TCO en tetrazine (Tz-BnNH 2; ~ 15 RU stijging van de respons, t = 540-1,140 sec). Geen signaal bederf optreedt ondanks het schakelen van de mobiele fase loopbuffer (t = 1,140-1,820 sec). 4) Regeneratie van de anti-GST oppervlak met 2 korte injecties van 10 mM glycine, pH 2,1 (t = 1,820-2,000 sec).
"Fo: src =" / files/ftp_upload/50772/50772fig3highres.jpg "/>
Figuur 3. Real-time monitoring van nanodeeltjes immobilisatie en functionalisatie. 1) Baseline. 2) Vastleggen van geïnjecteerd GST-Tz (t = 0-60 sec). 3) Cycloadditiereacties tussen vastgelegde GST-Tz en geïnjecteerd NP-TCO (t = 135-195 s), gevolgd door injectie van loopbuffer zonder afname in signaal (t = 195-300 sec). 4) Cycloadditiereacties tussen geïmmobiliseerde NP-TCO geïnjecteerd Tz-BnNH 2 (~ 22 RU stijging reactie, t = 300-360 sec). Er is geen signaal verval ondanks schakelen van de mobiele fase loopbuffer (t = 360-480 sec) bewijs voor meerdere componenten stabiliteit.
Figuur 4. Vertegenwoordiger sensorgrammen tonen bINDENDE data (rode lijnen) en kinetische analyses (zwarte lijnen) voor de cycloadditie reactie tussen Tz en TCO gemerkte moleculen in de aanwezigheid of afwezigheid van 100% FBS. Tabel vat associatie (cycloadditie) snelheidsconstanten k een.
Figuur 5. SPR studies van kleine molecule / eiwit interacties in verschillende configuraties (Top) Synthetische derivaten van FK506:. AP1497 en AP1497-Tz. De tabel toont kinetische en evenwichtswerkloosheid constanten afgeleid van bindende gegevens. Gegevens van bindingsexperimenten waar het eiwit wordt geïmmobiliseerd (bijvoorbeeld traditionele SPR experimenten) zijn opgenomen ter vergelijking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De capture-cycloadditiereactie hier beschreven methode maakt een snelle, omkeerbare immobilisatie van gemodificeerde nanodeeltjes en kleine moleculen voor label-free-chip gebaseerde interactie en kinetische studies. De immobilisatie protocol kan worden uitgevoerd minuten ter <10 uM concentratie van kleine moleculen liganden. Door het moduleren van ligand concentratie en contacttijd immobilisatie dichtheden nauwkeurig kan worden gecontroleerd. Onze gegevens tonen aan dat on-chip bioorthogonal reacties behoud van de mogelijkheid van in situ gefunctionaliseerde nanodeeltjes of geïmmobiliseerd kleine moleculen om te communiceren met hun doelstellingen. We hebben ook gekenmerkt bimolecular cycloadditie tarieven tussen twee kleine moleculen, (TCO en Tz) met een laag moleculair gewicht. Wij voorzien dat soortgelijke tests zijn uitgevoerd voor het meten en vergelijken bekijken van andere snelle bioorthogonal reacties.
Omkeerbare, continue stroming op-chip nanodeeltjes immobilisatie en in situ functionalisering provides snelle toegang tot een verscheidenheid van gemodificeerde nanopartikels voor screening en interactie analyse allemaal in hetzelfde experiment. 13-15 Vergeleken met conventionele nanodeeltjes synthese, die verschillende stappen voor zuivering, immobilisatie en screening vereist onze werkwijze vermindert ingangsgrootheden biomaterialen, oplosmiddelen en reagentia, en tegelijkertijd verminderen milieuoverwegingen omgaan met nanodeeltjes en verwijdering. 16 Belangrijk nanodeeltjes functionaliseringsreacties robuust de aanwezigheid van serum concentraties typisch voor celcultuur experimenten, en zelfs zeer hoge serumconcentraties. Deze functie kan structuur-activiteitsrelaties van nanodeeltjes ontwerp in aanwezigheid van serum (dat het eiwit corona en de oppervlakte-eigenschappen van de nanodeeltjes kunnen beïnvloeden) vergemakkelijken. 17,18
In de meeste SPR assays, waarbij eiwit-klein molecuul interacties worden bestudeerd, het eiwit (ligand) isgeïmmobiliseerd via een affiniteit tag (GST, biotine, enz.) of door covalente amide bindingen. De analyt wordt vervolgens over het ligand waar binding resulteert in oppervlaktemassa variaties, die worden gedetecteerd als brekingsindex verandert. Het omkeren van de canonieke SPR oriëntatie en immobiliseren van de kleine molecule in een handige en reversibele manier biedt gemakkelijke toegang directe binding van oplosbare macromoleculaire doelwitten om te studeren en verduidelijkt fasespecifiek (geïmmobiliseerd vs oplosbaar) artefacten. 19,20 Assay formaten van dit type zijn vooral waardevol voor remming en competitie studies. 21 Omkering van oriëntatie kan ook voordelig zijn onder verschillende omstandigheden, zoals a) analyten laag molecuulgewicht, aangezien bindende signaal is evenredig met de massa verandering b) aggregatie en niet specifiek hydrofobe analyten 22 oppervlak wordt geëlimineerd maken van data-analyse eenvoudig c) karakterisering van hoge affiniteit binders kunneneen uitdaging door lange verblijftijden (langzame off-rates, vooral als het gaat covalente remmers) 23 en de noodzaak oppervlak regeneratieomstandigheden als voorbereiding voor de volgende analysecyclus d) regeneratie middelen kunnen afbrekende effecten op de structuur of functie van het hebben geïmmobiliseerd eiwit.
Door de integratie van de bioorthogonal capture-cycloadditiereactie methode als onderdeel van onze strategie immobilisatie, omzeilen we een aantal van de problemen in verband met conventionele kleine molecule immobilisatie technieken. Deze vereisen veel hogere ligandconcentraties sinds elektrostatische attracties leidt tot pre-concentraties typisch voor eiwitimmobilisatie protocollen oppervlak zijn niet effectief met kleine moleculen. Dienovereenkomstig toenemende concentraties liganden leidt tot toenemende verhoudingen van organisch co-oplosmiddel voor ligand oplossen. Beide voorwaarden niet compatibel met microfluïdische stroom systemen en bijgevolg conventionele immobilizations moet buiten het instrument waar real-time monitoring niet mogelijk. 24 tenslotte bij een succesvolle conventionele immobilisatie, covalente modificatie van het oppervlak voorkomt oppervlak regeneratie en beperkt de experimentele reeks biosensor oppervlakken leidt tot hogere investeringen in tijd, inspanning worden uitgevoerd en kosten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij erkennen financiering van NIH (NHLBI Contract No HHSN268201000044C naar RW, SH en SYS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1005-30 | |
| Amine coupling kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| GST capture kit | GE Healthcare | BR-1002-23 | |
| NAP-10 Columns | GE Healthcare | 17-0854-01 | |
| GST, lyophilized in 1X PBS | Genscript | Z02039 | 1 mg/ml |
| rhFKBP12 | R&D Systems | 3777-FK | |
| Surfactant P-20 | GE Healthcare | BR-1000-54 | |
| Glycine 2.0 | GE Healthcare | BR-1003-55 | |
| Zeba spin desalting column | Thermo | 89882 | 7 K MWCO |
| Amicon Ultra 4 | Fisher | UFC810096 | 100 K centrifugal filter |
| TCO-OH | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| TCO-NHS | Ref. 8 | Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25 | |
| Tz-BnNH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Tz-NHS | Ref. 8 | 764701 | Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701 |
| NP-NH2 = CLIO-NH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| AP1497, AP1497-Tz | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Equipment | |||
| SPR Biosensor | GE Healthcare | Biacore T100 | |
References
- Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).
- Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry. ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).
- Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).
- Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells. J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection. Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).
- Liong, M., et al. Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance. Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).
- Tassa, C., et al. On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics. Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).
- Pol, E. The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis. J Vis Exp. (37), e1746 (2010).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
- Ong, S. E., et al. Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).
- Tassa, C., et al. Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles. Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).
- Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules. Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).
- Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol. Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).
- Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).
- Keelan, J. A.
- Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).
- Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study. ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).
- Mammen, M., Choi, S. -K., Whitesides, G. M. Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).
- Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor. Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).
- Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).
- Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors. J Med Chem. 51, 574-580 (2008).
- Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face. Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).
- GE Healthcare. Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. , Edition AB, (2005).
