La culture et entretien<em> Clostridium difficile</em> Dans un environnement anaérobie
Summary
Clostridium difficile est une bactérie pathogène qui est une bactérie anaérobie stricte et provoque la diarrhée associée aux antibiotiques (DAA). Ici, des méthodes d'isolement, la culture et le maintien C. des cellules et des spores végétatives difficile sont décrits. Ces techniques nécessitent une chambre anaérobie, qui nécessite un entretien régulier pour assurer des conditions adéquates pour optimale C. culture difficile.
Abstract
Clostridium difficile est un anaérobie, bactérie à Gram positif sporogène qui est principalement responsable de la diarrhée associée aux antibiotiques (DAA) et est un agent pathogène nosocomial important. C. difficile est notoirement difficile à isoler et à cultiver et est extrêmement sensible à même les niveaux d'oxygène dans l'environnement faibles. Ici, les procédés d'isolement de C. difficile à partir d'échantillons fécaux et la culture de la suite C. difficile pour la préparation des stocks de glycérol pour le stockage à long terme sont présentés. Des techniques pour la préparation et l'énumération des stocks de spores dans le laboratoire pour une variété d'applications en aval, y compris des études de microscopie et animaux sont également décrits. Ces techniques nécessitent une chambre anaérobie, qui maintient un milieu anaérobie cohérente afin de garantir des conditions adéquates pour optimale C. croissance difficile. Nous fournissons des protocoles pour le transfert de matériaux dans et hors de la chambre sans caen utilisant une contamination importante de l'oxygène ainsi que des suggestions pour l'entretien régulier nécessaire pour préserver l'environnement anaérobie approprié pour efficace et cohérente C. culture difficile.
Introduction
Clostridium difficile est une bactérie sporulée Gram positif qui est un anaérobie strict et un agent pathogène gastro-intestinal potentiellement mortelle de l'homme et les animaux. Initialement décrit en 1935 comme un organisme commensal trouvé dans les échantillons de selles des nouveau-nés 1, C. difficile a été démontré plus tard d'être l'agent causal de la colite pseudomembraneuse associée à un traitement antibiotique 2. C. infections difficile (ICD) sont généralement précédés par un traitement antibiotique qui se traduit par la perturbation de la flore colique normale, la création d'une niche pour C. difficile de prospérer 2. C. difficile est transmis sous forme d'une spore dormante par l'intermédiaire de la voie fécale-orale et par la suite germe dans le tractus gastro-intestinal, la production de cellules végétatives capable de générer plusieurs toxines et provoquer une maladie grave et la colite 3. CDI sont souvent réfractaires aux traitements conventionnels et ceux-ci enperfections sont souvent récurrentes 4. En conséquence, le CDI sont responsables de jusqu'à 4,8 milliards de dollars en coûts de soins de santé aux États-Unis 5-7.
C. difficile est très sensible même pour les niveaux d'oxygène dans l'environnement de faibles. Pour C. difficile de persister dans l'environnement et être efficacement transmis d'hôte à hôte, la formation d'une spore métaboliquement inactif est critique 8. Étant donné que le maintien et la manipulation de laboratoire de C. difficile nécessite un environnement anaérobie contrôlée, ces techniques nécessitent l'utilisation d'une chambre anaérobie. L'utilisation de chambres d'anaérobie a abouti à la récupération accrue et l'isolement des anaérobies stricts 9-11, et a permis un certain nombre de techniques moléculaires devant être exécutés dans une atmosphère anaérobie.
En plus de C. difficile, l'anaérobie utilisation de la chambre et l'entretien décrits ici sont applicablesà d'autres anaérobies stricts tels que d'autres espèces de Clostridium (par exemple C. perfringens), d'autres espèces gastro-intestinaux (par exemple, les espèces Bacteroides 12) et pathogènes parodontaux (par exemple, les espèces Peptostreptococcus 13).
Protocol
Representative Results
Discussion
Les méthodes décrites ici permettent de récupération simple et rapide de C. difficile à partir d'une variété d'échantillons de matières fécales, y compris les humains, les souris et les hamsters, ainsi que le stockage à long terme de C. difficile comme le glycérol ou spores des stocks. C. difficile peut être un organisme difficile à cultiver, mais une maintenance rigoureuse d'un environnement anaérobie et l'application des techniques d'asepsie peut prévoir u…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Coy laboratoires pour fournir aimablement des photos de la chambre anaérobie. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé subvention DK087763 (SMM) et un curriculum STEP / HHMI développement de la fraternité (ANE).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Proteose Peptone no. 2 | BD | 212120 | |
| Na2HPO4 | Fisher | S373 | |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| MgSO4 (anhydrous) | Fisher | M65 | |
| ᴅ-Fructose | Fisher | L96 | |
| Sodium taurocholate | Sigma | T4009 | |
| ᴅ-cycloserine | Sigma | C6880 | |
| Cefoxitin | Fluka | C4786 | |
| Brain heart infusion medium | BD | 237300 | |
| Proteose Peptone | BD | 211684 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A5132 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| L-cysteine | Sigma | C7755 | |
| BactoPeptone | BD | 211684 | |
| Columbian sheep blood agar | Fisher | L21928 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| KCl | Fisher | P217 | |
| Glycerol | Fisher | BP2291 | |
| Sterile inoculating loops | Fisher | 22363596 | |
| Sterile swabs | Fisher | 1495990 | |
| Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories | Coy Laboratory Products, Inc | Customer Specified | These items are custom ordered per laboratory needs |
| Materials | |||
| TCCFA agar Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhydrous) 0.1 g Fructose 6 g Agar 20 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add: 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 25 ml of 10 mg/ml ᴅ-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml) 1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml) BHIS Medium Brain heart infusion 37 g Yeast extract 5 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%) SMC Sporulation Medium BactoPeptone 90 g Protease peptone 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1.5 g Agar 15 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Protease peptone 3.5 g Brain heart infusion 11.1 g Yeast extract 1.5 g (NH4)2SO4 0.7 g Tris base 1.06 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%). Blood agar The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended. 1X Phosphate buffered saline (PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use. |
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