Embrionali di topo di sviluppo in un embrione di tutta la cultura di sistema privo di siero
Summary
Il siero utilizzato nelle culture embrione contiene componenti sconosciuti che possono influenzare l'esito degli esperimenti soprattutto in studi che coinvolgono le interazioni di segnalazione. Qui abbiamo utilizzato un sistema di coltura ossigenato senza siero e dimostrare che embrioni di topo metà della gestazione in coltura per 16-40 ore esibiscono sviluppo morfologico paragonabile agli embrioni in via di sviluppo in utero.
Abstract
Embrioni metà della gestazione del mouse fase sono state coltivate utilizzando un mezzo di coltura privo di siero preparato da disponibili in commercio integratori multimediali cellule staminali in un sistema di coltura bottiglia di laminazione ossigenato. Embrioni di topo a E10.5 sono stati attentamente isolati dal dell'utero con intatta sacco vitellino e, in un processo che coinvolge manovra chirurgica precisione gli embrioni sono stati gentilmente esteriorizzato dal sacco vitellino, pur mantenendo la continuità vascolare dell'embrione con il sacco vitellino. Rispetto agli embrioni preparati con intatta sacco vitellino o con il sacco vitellino rimosso, questi embrioni esposti tasso di sopravvivenza superiore e progressione evolutiva quando coltivate in condizioni simili. Abbiamo dimostrato che questi embrioni di topo, quando coltivate in un mezzo definito in un'atmosfera di 95% O 2/5% di CO 2 in un apparecchio di coltura bottiglia rotolamento a 37 ° C per 16-40 ore, mostrano crescita e sviluppo morfologico paragonabile a gli embrioni in via di sviluppo in utero. Crediamo thè il metodo sarà utile per gli investigatori che hanno bisogno di utilizzare tutta la cultura dell'embrione per studiare le interazioni di segnalazione importanti nell'organogenesi embrionale.
Introduction
In vitro metodi colturali che utilizzano embrioni integrali sono adatti a studiare meccanismi di segnalazione coinvolti nella organogenesi embrionale che sono altrimenti di difficile accesso in utero. Embrioni integrali forniscono l'integrità dei tessuti e un sostegno adeguato per le interazioni dei tessuti che sono cruciali per la tempestiva presenza di meccanismi di segnalazione essenziali per i diversi processi cellulari durante l'organogenesi. Mentre intere culture embrione di fornire una piattaforma per una pletora di applicazioni come gli studi di trapianto, manipolazioni genetiche e biologiche, studi tallone di impianto, gli studi tossicologici, ecc., Sistemi di coltura di embrioni attualmente utilizzati sono prevalentemente a carico del siero per la corretta crescita e il mantenimento degli embrioni nella cultura 1-9.
Il siero è stato utilizzato come uno dei principali componenti che vanno dal 10-100% dei terreni di coltura 6-8, 10, 11., Tuttavia, la composizione del siero non è ben definito e può differire da un animale all'altro e ogni volta il siero viene raccolto. Mentre la preparazione del laboratorio di siero molto tempo e comporta procedure rigorose, siero procurato esibisce in commercio una notevole variabilità tra i diversi lotti e aumenta i costi sperimentali. In aggiunta a questi, il siero può contenere incognite, quali fattori di crescita, ormoni o altre proteine, che possono potenzialmente influenzare l'esito di alcuni esperimenti, in particolare quelli che riguardano lo studio di molecole di segnalazione importanti nelle interazioni tissutali. Studi hanno dimostrato che l'aggiunta di siero di cultura può potenzialmente alterare i livelli intracellulari di alcune molecole di segnalazione come adenosina monofosfato ciclico (cAMP) e proteine coinvolte nella segnalazione mitogenico e phosphoinositide 3 (PI 3)-chinasi vie di segnalazione 12-14. Contrariamente a questi, un sistema esente da siero fornisce i vantaggi di ambiente antigene libero,astinenza da enzimi biologicamente attivi che possono alterare i processi cellulari e permette la coerenza tra esperimenti.
Nel presente studio, abbiamo utilizzato un mezzo di coltura privo di siero preparato da integratori multimediali cellule staminali disponibili in commercio per cultura stadio intermedio di gravidanza embrioni interi in un'atmosfera di 95% O 2/5% di CO 2 in un apparecchio di coltura bottiglia laminazione a 37 ° C 15,16. Embrioni di topo in coltura per 16 a 40 ore in queste condizioni definite esposti progressione in sviluppo morfologico delle strutture corporee e diversi embrionali quali il cuore, arti, cervello e occhi indicando adeguati livelli di proliferazione cellulare, la migrazione, la differenziazione e interazioni tissutali. Analisi molecolare dello sviluppo embrionale nella cultura di uno dei sistemi di organi complessi come l'occhio rivelato lo sviluppo oculare essere coerente con quello osservato nel tessuto oculare in embryos sviluppo in utero (Kalaskar e Lauderdale, in preparazione). Così dimostriamo che gli embrioni di topo coltivate in fase metà della gestazione, mostrano una progressiva crescita e sviluppo morfologico paragonabile a quella osservata negli embrioni di sviluppo in utero.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embrioni metà della gestazione topo fase sono state coltivate in un mezzo di coltura privo di siero in un'atmosfera di 95% O 2/5% di CO 2 in un apparecchio di coltura bottiglia rotolamento a 37 ° C. Sviluppo embrionale ex utero è criticamente dipendente da molteplici fattori ad ogni passo durante la procedura dal momento in cui il utero è isolato dai topi sacrificati al completamento della coltura (Figura 1). Il fattore più importante che influenza lo sviluppo è …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il Dott. Julie Gordon e il Dr. Nancy Manley per il loro consiglio utile con la tecnica cultura. Questo lavoro è stato sostenuto da Glaucoma Fondazione dei Bambini e Sharon-Stewart aniridia Research Trust.
Materials
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotic – Antimycotic Solution | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 µg/ml; Amphotericin (250µg/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Precision Incubator Unit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | B.T.C. Engineering | ||
| Silicone Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Microscope | Zeiss | ||
| CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Culture Hood | Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Weigh Balance | Mettler Toledo | AG285 | |
| Centrifuge Tube – 50ml | Corning | 430291 | |
| Light Operating Scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Operating Sharp-Blunt Scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Micro Dissecting Forceps – 4” | Roboz | RS-5211 | |
| Micro Dissecting Forceps – Hudson (cWALD) – 4-3/4” | Roboz | RS-5237 | |
| Micro Dissecting Tweezers (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (5) | Roboz | RS-5060 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (55) | Roboz | RS-5063 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Instrument Tray | Roboz | RT-1401S | |
| Instrument Tray Lid | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Dish-100mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Dish-60mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml | Corning | 431153 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml | Corning | 430756 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipetter | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serological Pipette-10ml | VWR | 89130-898 | |
| Disposable Serological Pipette-25ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipette – 7.7ml | Thermo Scientific | 202-20S |
Riferimenti
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