Muis embryonale ontwikkeling in een Serumvrij Hele Embryo Cultuur System
Summary
Serum gebruikt in embryocultures bevat onbekende componenten die het resultaat van experimenten vooral in studies met signalering interacties beïnvloeden. Hier gebruikte we een serumvrij zuurstof kweeksysteem aantonen dat mid-dracht muizenembryo's gekweekt gedurende 16-40 uur vertonen morfologische ontwikkeling vergelijkbaar embryo ontwikkeling in utero.
Abstract
Mid-dracht stadium muizenembryo's werden gekweekt met behulp van een serum-vrij kweekmedium bereid uit in de handel verkrijgbare stamcel media supplementen in een zuurstofrijk rollende fles kweeksysteem. Muizenembryo's op E10.5 werden zorgvuldig geïsoleerd uit de baarmoeder met intacte dooierzak en werkwijzen waarbij nauwkeurige chirurgische handeling de embryo voorzichtig werden naar buiten gebracht vanuit de dooierzak terwijl de vasculaire continuïteit van de embryo met de dooierzak. Vergeleken met embryo's voorbereid met intacte dooierzak of met de dooierzak verwijderd, deze embryo's tentoongesteld superieure overleving en ontwikkeling progressie indien gekweekt onder vergelijkbare omstandigheden. We zien dat deze muizenembryo's, indien gekweekt in een gedefinieerde medium in een atmosfeer van 95% O 2/5% CO 2 in een rollende fles kweek inrichting bij 37 ° C gedurende 16-40 uur, vertonen morfologische groei en ontwikkeling vergelijkbaar de embryo ontwikkeling in utero. Wij geloven eis de methode nuttig zal zijn voor onderzoekers om hele embryo cultuur gebruiken om signalering interacties belangrijk in embryonale organogenese bestuderen.
Introduction
In vitro kweek methoden gebruik te maken van hele embryo's zijn zeer geschikt om te studeren signalering mechanismen die betrokken zijn bij de embryonale organogenese die anders moeilijk te bereiken in de baarmoeder. Hele embryo's bieden de weefsel integriteit en geschikt is voor het weefsel interacties die cruciaal zijn voor het tijdig voorkomen van signaleringsmechanismen essentieel zijn ondersteuning voor verschillende cellulaire processen tijdens organogenese. Terwijl de hele embryo culturen bieden een platform voor een overvloed aan toepassingen zoals transplantatie studies, genetische en weefsel manipulaties, kraal implantatie studies, toxicologische studies, enz., Momenteel toegepast embryo cultuur systemen zijn voornamelijk afhankelijk van het serum voor een goede groei en het onderhoud van de embryo's in de cultuur 1-9.
Serum is gebruikt als een van de belangrijkste componenten vinden van 10-100% van het kweekmedium 6-8, 10, 11., De samenstelling van serum is niet goed gedefinieerd en kunnen van dier tot dier en elke keer het serum verzameld. Terwijl laboratorium voorbereiding van het serum is tijdrovend en het gaat om strenge procedures, serum verkregen commercieel vertoont een aanzienlijke variatie tussen verschillende partijen en verhoogt experimentele kosten. Naast deze, kan het serum onbekende factoren zoals groeifactoren, hormonen of andere eiwitten, die mogelijk invloed hebben op de uitkomst van bepaalde experimenten, met name die de studie van signaalmoleculen belangrijk weefselinteractie inhouden. Studies hebben aangetoond dat toevoeging van serum cultuur mogelijk de intracellulaire niveaus van bepaalde signaalmoleculen zoals cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP) en eiwitten betrokken bij mitogene signalering en fosfoinositide 3 (PI3)-kinase signaalwegen 12-14 kan veranderen. Anders dan deze, een serumvrije biedt de voordelen van antigeen vrije omgeving,onthouding van biologisch actieve enzymen die de cellulaire processen veranderen en maakt samenhang tussen experimenten.
In de huidige studie hebben we gebruik gemaakt van een serum-vrij kweekmedium bereid uit in de handel verkrijgbare stamcel media aanvullingen op cultuur medio zwangerschap stadium hele embryo's in een atmosfeer van 95% O 2/5% CO 2 in een rollende fles cultuur apparaat bij 37 ° C 15,16. Muizenembryo's gekweekt gedurende 16-40 uur onder deze gedefinieerde omstandigheden vertoonden progressie morfologische ontwikkeling van embryonale totale lichaam en verschillende structuren zoals het hart, ledematen, hersenen en de ogen aangeeft passende niveaus van cellulaire proliferatie, migratie, differentiatie en weefsel interacties. Moleculaire analyse van de embryonale ontwikkeling in de cultuur van een van de complexe orgaansystemen zoals het oog bleek de oculaire ontwikkeling overeen met die waargenomen bij oculaire weefsel embr teJo's ontwikkelen in de baarmoeder (Kalaskar en Lauderdale, in voorbereiding). Zo tonen we muizenembryo's gekweekt halverwege zwangerschap stadium vertonen progressieve groei en morfologische ontwikkeling vergelijkbaar met die waargenomen bij embryo ontwikkeling in utero.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mid-dracht stadium muizenembryo's werden gekweekt in een serumvrij kweekmedium in een atmosfeer van 95% O 2/5% CO 2 in een rollende fles cultuur apparaat bij 37 ° C. Embryo ex utero was sterk afhankelijk van meerdere factoren bij elke stap in de procedure vanaf het moment dat de baarmoeder wordt geïsoleerd uit de muizen gedood om de voltooiing van de kweek (Figuur 1). De belangrijkste factor die de ontwikkeling invloed was de tijd voor de kweek te starten. De andere …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag Dr Julie Gordon en Dr Nancy Manley bedanken voor hun nuttige adviezen met de cultuur techniek. Dit werk werd ondersteund door de Children's Glaucoom Stichting en Sharon-Stewart Aniridia Research Trust.
Materials
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotic – Antimycotic Solution | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 µg/ml; Amphotericin (250µg/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Precision Incubator Unit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | B.T.C. Engineering | ||
| Silicone Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Microscope | Zeiss | ||
| CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Culture Hood | Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Weigh Balance | Mettler Toledo | AG285 | |
| Centrifuge Tube – 50ml | Corning | 430291 | |
| Light Operating Scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Operating Sharp-Blunt Scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Micro Dissecting Forceps – 4” | Roboz | RS-5211 | |
| Micro Dissecting Forceps – Hudson (cWALD) – 4-3/4” | Roboz | RS-5237 | |
| Micro Dissecting Tweezers (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (5) | Roboz | RS-5060 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (55) | Roboz | RS-5063 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Instrument Tray | Roboz | RT-1401S | |
| Instrument Tray Lid | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Dish-100mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Dish-60mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml | Corning | 431153 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml | Corning | 430756 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipetter | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serological Pipette-10ml | VWR | 89130-898 | |
| Disposable Serological Pipette-25ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipette – 7.7ml | Thermo Scientific | 202-20S |
Riferimenti
- Behesti, H., Holt, J. K., Sowden, J. C. The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup. BMC Dev. Biol. 6, 62 (2006).
- Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J. Vis. Exp. , (2011).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. Int. J. Dev. Biol. 42, 895-902 (1998).
- Miura, S., Mishina, Y. Whole-embryo culture of E5.5 mouse embryos: development to the gastrulation stage. Genesis. 37, 38-43 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Yokoo, T., et al. Human mesenchymal stem cells in rodent whole-embryo culture are reprogrammed to contribute to kidney tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3296-3300 (2005).
- Sadler, T. W. Culture of early somite mouse embryos during organogenesis. J. Embryol. Exp. Morphol. 49, 17-25 (1979).
- Kitchin, K. T., Ebron, M. T. Further development of rodent whole embryo culture: solvent toxicity and water insoluble compound delivery system. Toxicology. 30, 45-57 (1984).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev. Growth Different. 50, 485-497 (2008).
- Cuthbertson, R. A., Beck, F. Postimplantation whole embryo culture: a new method for studying ocular development. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 31, 1653-1656 (1990).
- New, D. A. Development of explanted rat embryos in circulating medium. J. Embryol. Exp. Morphol. 17, 513-525 (1967).
- Chung, K. C., Park, J. H., Kim, C. H., Ahn, Y. S. Tumor necrosis factor-alpha and phorbol 12-myristate 13-acetate differentially modulate cytotoxic effect of nitric oxide generated by serum deprivation in neuronal PC12 cells. J. Neurochem. 72, 1482-1488 (1999).
- Sasaoka, T., et al. Evidence for a functional role of Shc proteins in mitogenic signaling induced by insulin, insulin-like growth factor-1, and epidermal growth factor. J. Biol. Chem. 269, 13689-13694 (1994).
- Chotani, M. A., Mitra, S., Eid, A. H., Han, S. A., Flavahan, N. A. Distinct cAMP signaling pathways differentially regulate alpha2C-adrenoceptor expression: role in serum induction in human arteriolar smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, 69-76 (2005).
- Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
- Gordon, J., Moore, B. A., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Serum-Free Culture of Mid-gestation Mouse Embryos: A Tool for the Study of Endoderm-Derived Organs. Methods Mol. Biol. 1092, 183-194 (2014).
- New, D. A., Cockroft, D. L. A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase. Experientia. 35, 138-140 (1979).
- Cockroft, D. L. Development in culture of rat foetuses explanted at 12.5 and 13.5 days of gestation. J. Embryol. Exp. Morphol. 29, 473-483 (1973).
- Zeeb, M., et al. Pharmacological manipulation of blood and lymphatic vascularization in ex vivo-cultured mouse embryos. Nat. Protoc. 7, 1970-1982 (2012).
- Wawersik, S., et al. BMP7 acts in murine lens placode development. Dev. Biol. 207, 176-188 (1999).
- Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).
- Greenfield, J. P., et al. Estrogen lowers Alzheimer beta-amyloid generation by stimulating trans-Golgi network vesicle biogenesis. J. Biol. Chem. 277, 12128-12136 (2002).
- Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39, 100-104 (2004).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, 649-643 (2009).
- Totonchi, M., et al. Feeder- and serum-free establishment and expansion of human induced pluripotent stem cells. Int. J. Dev. Biol. 54, 877-886 (2010).
